VITVO® 抗癌治疗效果的实时成像

Maria Giubettini(1), Alessandra Scarpellini(1), Giulia Grisendi(2,3), Stella Frabetti(4), Olivia Candini(4), Elisa Gregianin(4)

  1. CrestOptics公司,罗马,意大利
  2. 意大利摩德纳市摩德纳和雷焦艾米利亚大学儿童与成人医学和外科科学院
  3. 意大利摩德纳市梅多拉的Rigenerand公司细胞和基因治疗研发部
  4. 意大利摩德纳市梅多拉的Rigenerand公司3D细胞培养技术部

介绍

基于细胞的疗法为癌症的治疗提供了相关的临床选择,是传统药物无法对抗的[1]。对基于细胞的药物方法进行临床前评估需要开发能够模拟细胞生长影响分子生物标志物和抗原特征的临床环境的生物相关模型。与经典的二维培养系统相比,三维(3D)平台有可能为药物发现和毒理学中的细胞培养提供更多的生理环境,并模拟一个类似在生物体内进行的背景,从而在人类化身的环境中进行测试。

VITVO®是一种体外创新临床前测试工具,它以即用设备的形式呈现。此设备由用于3D细胞定殖的纤维基矩阵组成,以模拟组织复杂性[2]。VITVO可以同时宿载靶细胞和效应细胞,从而既能评估抗肿瘤作用,又能识别有效剂量。在这项研究中,表达抗癌分子TRAIL(AD-MSC TRAIL)[3]的基因改造和脂肪衍生间质频谱/干细胞因其诱导尤因肉瘤(A673 肿瘤细胞株)凋亡的能力而面临挑战。

为了直接监测AD-MSCs TRAIL在单细胞水平上对A673尤因肉瘤细胞的影响,我们进行了CrestOptics X-Light V3共聚焦旋转盘的延时实验,遵循同一VITVO环境中的3个不同领域,从治疗后24小时监测到治疗后96小时。此外,通过使用CrestOptics X-Light V3共聚焦旋转盘作为确认,在固定样品上进行了端点成像。

Figure 1. Experimental workflow.

材料和方法

细胞培养:尤因肉瘤A673肿瘤细胞株是从ATCC(意大利米兰的LGC Standards公司)购买,并通过病毒感染进行了基因改造,以表达dsRED荧光蛋白:根据jetPEI协议(美国马萨诸塞州丹弗斯的细胞信号技术公司),逆转录病毒载体MSCV-dsRED與助手质粒的混合物被瞬时地传播到293T细胞。48小时后,收集了含有逆转录病毒颗粒的条件培养基,以稳定地转导FLYRD18包装细胞株,以持续制造病毒颗粒。FLYRD18条件培养基用于在肿瘤细胞株上执行3次感染(每天培养6小时)。

A673是在Iscove培养(英国帕丁顿的Euroclone公司),补充以10%的胎儿牛血清(FBS,奥地利帕辛的PAA公司),1%谷氨酰胺(200mM),和1%青霉素-链霉素(104UI/mL和10mg/mL;都来自Euroclone公司)。

AD-MSC TRAIL如前所述的方法获得[3] 。

对于共培养环境,Iscove补充了10%胎儿牛血清、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素。

VITVO加载:VITVO生物反应器(意大利摩德纳市梅多拉的Rigenerand公司)首先使用2.5毫升注射器准备1.4毫升单独的培养基(美国新泽西州富兰克林湖的Becton Dickinson and Co公司),以确保 3D矩阵完全湿润。接下来,A673靶细胞(500,000/VITVO)在1毫升培养基中重新悬浮,并在VITVO中播种,24小时后,在已經使用于A673细胞株的加载程序之后将AD-MSC TRAIL效应器(50,000/VITVO)添加到VITVO中。

效应器共培养:靶细胞(1:10)维持培养到96小时

样品固定:通过在VITVO注射4%冷多聚甲醛(PFA)固定溶液(德国达姆施塔特市的默克集团)并在室温(RT)下繁殖15分钟(min),共培养在治疗后24小时和72小时停止。PBS清洗后,通过采用手术刀切割透明膜的边缘和3D矩阵来收集3D矩阵。矩阵安装在幻灯片上(播种面向上),带有一滴安装溶液和盖片。

显微镜监测和3D成像:已使用配备了Crestoptics X光V3共聚焦旋转盘、摄氏37度的Okolab培养器(H301-K-FRAME,由Okolab提供)、Celesta激光源(Lambda使用470和545:Lumencor)和Prime 95B相机(11 微米像素大小,1608×1608像素,Photometrics)的尼康Ti2 Eclipsed显微镜进行了延时采集。对于72小时长期实时成像,已使用尼康4x Plan Apo物镜(air, 0.2 NA),Z级为10微米,总Z体积为450微米。VITVO设备中的三个不同区域在前6小时以30分钟的采集速率进行监控,然后在视频的其余部分每小时监控一次。在视频的结尾对活细胞进行成像,使用4x Plan Apo物镜(air, 0.2 NA) ,Z级为10微米,总Z体积为450微米。

固定样品的采集,在特定时间点收集(治疗后24小时和72小时),已经通過使用Z级为2微米,总Z体积为100-150微米的10x Plan Apo(air, 0.45 NA)物鏡以CrestOptics X光V3共聚焦旋转盘进行。

结果和讨论

为了实时监测AD-MSCs TRAIL的能力,随着时间的推移诱导对尤因肉瘤A673细胞的凋亡效应,共同培养被保存到Okolab培养器中,并持续成像,直到治疗后96小时

在图2中,显示了治疗后24小时收集在xyz维度中的全视野视景(FOV)。由于相机的25毫米对角线全视野视景和在不失去旋转磁盘共焦性的情况下穿透样品内的能力,它可以可视化和记录细胞均匀地定殖在3D矩阵的整个厚度

图2。治疗后24小时用旋转磁盘获得的整个全视野视景(FOV)的三维视图。全视野视景(FOV)采用XY=4422×4422μm、Z=530μm。3D矩阵厚度己被完全获得。肿瘤靶点A673细胞以红色显示,AD-MSC以绿色显示。

沿Z轴线监测了三个VITVO区域,并随着时间的推移进行监测以便录制电影。三个区域之一的代表性整体电影能够欣赏AD-MSC TRAIL(绿色)向A673肿瘤细胞(红色)移动的剧烈活动,这表明其细胞形态发生了巨大变化(图 3)。

图3。代表电影记录了采用旋转盘的三个VITVO区域之一。显示了每个 时间范围的反褶积Z最大强度投影。

在沿电影创建的Z-sum强度投影图像中,通过识别荧光细胞(尼康NIS Elements软件工具)周围的感兴趣区域(ROIs),对AD-MSC TRAIL(绿色荧光)和 A673肿瘤细胞(红色荧光)覆盖的区域进行了量化。一部代表电影在图4A显示。为了评估AD-MSCs TRAIL对A673肿瘤细胞的杀伤效果,随着时间的推移对细胞覆盖的总面积(图4B)进行了测量和量化。如曲线图所示,红色覆盖区域在48小时治疗后首先降至50%,在72小时治疗后进一步降至8%,在96 小时治疗后进一步降至2%。被观察到的趋势表明,在考虑的时间范围内,完全监测了前细胞凋亡过程被有效地激活。相反,随着时间的推移,AD-MSC TRAIL保持良好的区域覆盖范围。治疗后96小时轻微下降到35%的原因可能是细胞有能力迁移到仍然存活的肿瘤细胞,同时考虑到它们在图3电影中观察到的剧烈活动。

图4。沿电影的蒙太奇手法和二元区域测量。 (A)两个二元区域(绿色和红色)的代表视频。(B)通过以下计算测量和量化了从第一个(治疗后24小时)到最后一个时间范围(治疗后96小时)细胞覆盖的总区域:(%=(二元区域(μm2)每个时间点*100)/二元区域(μm2)起点)。

为了进一步确认AD-MSC TRAIL的迁移能力及其抗肿瘤活性,我们专注于一个小区域,以创建收集所有动态事件的3D电影。AD-MSC TRAIL通过围绕A673肿瘤细胞在VITVO 3D基质内积极迁移,这极大地改变了它们的形态,直到死前形成凋亡小体(图5A)。图5B显示细胞轨迹和测量结果。极地图显示,AD-MSCs TRAIL(GFP)的速度大约是A673肿瘤细胞(dsRED)的三倍(速度分别为少于0.015 um/s和少于0.0050 um/s)。

图5。A)用旋转盘获得的放大兴趣区域中的3D电影。B)细胞跟踪电影和极地图测量。

为了确认观察到的凋亡效应不是由于录像过程中的激光曝光,我们比较了激光曝光区域(全视野视景(i)) 和VITVO(全视野视景(ii))內未曝光区域。使用在延时摄影期间采用的相同设置执行的Z-stack采集,允许确认兩个区域覆盖范围和细胞密度在全视野视景(i)和(ii)之间具有可比性,如3D渲染可视化(图 6)所示。

图6。通过旋转盘获得在VITVO中治疗后96小时收集的3D视图。延时电影期间的VITVO暴露区域的全视野视景(i)和未暴露区域的全视野视景(ii)(4倍物镜放大率)。

此外,为了排除漂洗副作用,还量化了红荧光细胞的信号强度。具体来说,荧光强度阈值检测到的3D物体显示了两种不同全视野视景之间的可比分布,确认漂洗没有影响强度水平(图7)。

图7。A673肿瘤细胞的3D目标检测和荧光强度分布。暴露区域的全视野视景(i)和未暴露区域的全视野视景(ii)。下图中的每个点对应于检测到的单个3D目标。

从VITVO共培养物的实时监测中获得的数据与治疗后特定时间点的固定样本的端点读数进行了比较(24和72小时,图8)。三种不同全视野视景之间的3D比较证实了细胞的均匀分布没有任何显著的场间差异。这些数据表明,AD-MSC TRAIL是随着时间的推移而持续存在的,而A673肿瘤细胞的信号和细胞密度大幅下降(图8)。

图8。VITVO全视野视景上的Z-stack通过旋转盘收集并固定在不同的时间点。3种不同的全视野视景分别对应治疗后24小时和72小时的固定样品(10倍物镜放大率)。 

结论

这项研究显示,VITVO好像是一个合适的工具,可以方便、直接和持续地监测共同培养物数天,以深入检查基于细胞的治疗(AD-MSCs TRAIL)对肿瘤靶点(A673尤因肉瘤细胞)的影响。由于CrestOptics的旋转盘成像技术,随着时间的推移,在整个全视野视景和单细胞水平上以高分辨率收集了大量数据。3D环境中的培养变化,如凋亡效应和细胞迁移能力,可以很容易地测量和量化。

随着时间的推移监测活细胞培养的可能性提供了在整个实验期间修改和调整条件的优势,也为终点研究选择适当的时间点。  此外,来自同一VITVO的多个数据采集既无需为每个端点读数使用一台设备,也无需在复制之间进行变异。

与固定终点研究相比,通过使用这种活成像旋转盘的方法,可以监测和分析药物反应、细胞和组织之间的相互作用,以便通过更大的空间和时态理解提供更稳健、更完整的动态生物过程图景。VITVO中,通过提高预测性和加快临床前过程时间表,抗肿瘤行动的成像可以为药物的发现和开发提供新而有趣的机会

参考

  1. Bhere D, Shah K,《基于干细胞的癌症治疗》(Stem Cell-Based Therapies for Cancer)。Adv Cancer Res.杂志2015年; 127:159-89。PMID号: 26093900
  2. Candini O, Grisendi G, Foppiani以及其他人用于药物测试、基因治疗和免疫肿瘤学临床前研究的新型3D体外平台。Sci Rep.期刊2019年;9(1):7154.2019年5月。doi:10.1038/s41598-019-43613-9.
  3. Grisendi G, Bussolari R, Cafarelli L以及其他人脂肪衍生间质干细胞作为用于癌症治疗的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体传递的稳定来源。Cancer Res.杂志2010年5月 1;70(9):3718-29. doi: 10.1158 0008 -5472.

RIGENERAND Srl

Via Maestri del Lavoro, 4

41036 Medolla (MO) ITALY

Tel. +39 0535 187.61.72

www.rigenerand.it

如要询问报价或查找VITVO的经销商,请访问我们的网站:www.rigenerand.it/vitvo 并发送电邮到orders@rigenerand.it

Subscribe to MicroLife to receive a monthly update on CrestOptics application notes

Share this Article
Share on linkedin
Share on facebook
Share on twitter
Share on whatsapp
Share on email

Subscribe to MicroLife to receive a monthly update on CrestOptics application notes