罗马 Consiglio Nazionale delle Ricerche 分子生物学与病理学研究所 Giulia Fianco 博士与 Giulia Guarguaglini 博士合作设计。
乳腺癌是女性最常见的癌症之一（“癌症事实和数据”，美国癌症协会，2011），随着图像分析和分类的定量工具的发展，诊断准确率显著提高。
高含量成像 (HCI) 是从生物图像中提取高含量数据的基于图像的有力范例代表。 该成像系统包括采集、处理和分析步骤，用于大幅提高成像通量和量化；每个步骤均为高度计算机驱动，用户能够加速重复操作，从而减少人为干预和偏倚。
本应用说明介绍了一种在三维 (3D) 乳腺上皮细胞培养物中对乳腺癌进行自动成像和分析的方法。 特别是，我们开发了一种图像分析框架，用于通过腺泡结构形态表征对体外 3D 乳腺上皮腺泡进行自动成像。
3D 腺泡样球体自动成像
HCI 所采用的成像采集技术需要一个能够在短时间内采集大量图像的系统；然而，速度并非唯一要求。 事实上，HCI 经常被应用于 3D 样本，这些样本最能概括正确的组织生理学或病理学。 因此，对于这种类型的应用，必须有一种也能够具有足以正确解析复杂生物结构的纵向分辨率的系统。
特别是在需要对厚 3D 结构进行形态学研究的情况下，普通的宽视野 (WF) 技术可能只给出样本的近似视图。 在这种情况下，图 1 比较了采用 WF 和共焦 (CF) 成像模式采集的两个 60 um 厚的球体图像。 因此，由于 CF 能够提供更好的 Z 采样，因此可更好地分辨看起来像单个大球体结构的两个球体，这在完成形态学研究时至关重要。
体外上皮乳腺细胞可在基底膜基质（基质胶）中培养，以促进腺泡样结构的形成。 这种 3D 培养系统在形态和结构上均类似于乳腺和小叶的体内腺泡，为乳腺癌研究提供了合适和可控的环境（Martin等人，2008）（Weigelt 和 Bissel， 2008）。
本应用说明描述了基于 CrestOptics X-Light V3 旋转盘的高含量平台，该平台被应用于对源自 MCF10A 细胞系（源自具有纤维囊性改变的乳腺组织的永生化上皮细胞）的 3D 乳腺培养球体进行形态学分析。 在非恶性、非侵袭性癌细胞 (MCF10A-CTR) 以及恶性和侵袭性癌细胞 (MCF10A K-Ras) 中研究了乳腺腺泡培养物的结构特征，MCF10A K-Ras 是一种通过工程控制细胞产生的用于稳定表达小 GTP 酶 Ras 致癌突变形式 (K-Ras) 的细胞系。
图 1： 60 um 球体的 WF 与 CF 旋转盘体积视图比较。 这些图像是用 CFI Plan Apochromat Lambda D 60 倍油物镜（60 倍，尼康，1.42 数值孔径和 0.15 mm 工作距离）采集。
图 2 显示了两个在 3D 基质胶悬浮液中生长的早期阶段（体外三天，DIV 3）代表性非恶性腺泡。 微管蛋白（绿色）能够识别骨架，因此能够识别球体结构，而中心粒周蛋白（红色）能够识别有丝分裂纺锤体的正确方向，因此能够识别球体内细胞分裂的对称性。
在发育的早期阶段，腺泡结构开始呈现非常规则的圆形结构，并且具有极化腔上皮细胞。 由于有细胞连接和粘附蛋白，相邻细胞具有紧密连接的侧膜。 细胞顶面朝向中空的生长腔，而其基面与周围的 ECM 蛋白接触。
在恶性肿瘤中，细胞极性的丧失会导致腺泡结构的形态学发生变化，在本研究中，我们研究了腺泡体积、球形度、伸长率、表面积和直径等形态学特征。
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图 2： 典型非恶性腺泡结构横断面示例 (A)。 典型非恶性腺泡 3D 体积视图 (B)。 在 3D 基质胶悬浮液中进行细胞培养，并用微管蛋白（绿色）、中心粒周蛋白（红色）和 DAPI（蓝色）染色。 这些图像是用 CFI Plan Apochromat Lambda D 60 倍油物镜（60 倍，尼康，1.42 数值孔径和 0.15 mm 工作距离）采集。
为此，我们使用 NIS-Elements JOBS 模块定义了 HCI 管道（图 3）。 NIS-Elements 软件的 JOBS 模块使用户能够在无需任何高级数据编程知识情况下，使用定制的采集和分析软件设计实验。 任何实验均可通过拖放用户想要级联或重叠的功能来创建，图 3 展示了我们的成像工作流示例。 特别是，DIV 6 腺泡（非恶性和致瘤细胞系）是在 96 孔板中培养，根据成像方案，我们能够选择孔并以全自动方式用 20 倍空气物镜（CFI Plan Apochromat Lambda D 20x，尼康，0.8 数值孔径和 0.8 mm 工作距离）进行多色（DAPI、GFP和RFP）Z 堆栈 (60 μm) 采集。
图 3： JOB 定义工作流程示例。 在每个选定孔中以循环方式采集多色 Z 堆栈。
图 4 显示了非恶性 (A) 和致瘤 (B) 腺泡的 60 um Z 堆栈的最大密度投影 (MIP)。 通过在整个 25 mm 视场 (FOV) 内提供均匀照明，X-Light V3 共焦旋转盘使我们能够分析大量腺泡，减少获得可靠数据所需的图像数量，从而最大限度地缩短采集时间。
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图 4： 非恶性 (A) 和致瘤腺泡 (B) 的60 um Z 堆栈 MIP。 在 3D 基质胶悬浮液中进行细胞培养并用中心粒周蛋白（红色）和 DAPI（蓝色）染色。 这些图像是用 CFI Plan Apochromat Lambda D 20 倍空气物镜（20 倍，尼康，0.8 数值孔径和 0.8 mm 工作距离）采集。
基质胶基质对于支持腺泡生长及其 3D 结构的正确形成而言至关重要；然而，将样品包埋在如此致密和不透明基质中会使成像更加复杂。 基质胶制剂也可能具有高度的自发荧光，这会降低信噪比。 尽管存在这些挑战，但如图 5 所示的正交投影及图 6 所示的体积视图所示，X-Light V3 共焦旋转盘能够许获得优异的切片和图像质量。
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图 5： 非恶性 (A) 和致瘤腺泡 (B) 正交视图。 在 3D 基质胶悬浮液中进行细胞培养并用中心粒周蛋白（红色）和 DAPI（蓝色）染色。这些图像是用 CFI Plan Apochromat Lambda D 20 倍空气物镜（20 倍，尼康，0.8 数值孔径和 0.8 mm 工作距离）采集
图 6： 致瘤腺泡 3D 影片。 在 3D 基质胶悬浮液中进行细胞培养并用中心粒周蛋白（红色）和 DAPI（蓝色）染色。 本图像是用 CFI Plan Apochromat Lambda D 20 倍空气物镜（20 倍，尼康，0.8 数值孔径和 0.8 mm 工作距离）采集。
乳腺培养腺泡的自动分析与形态学分析
在完成 HCI 后，我们进行了自动分析，以确定 3D 乳腺培养腺泡的形态学特征。
腺泡结构的形态学研究是使用 NIS-Elements 综合分析 (GA3) 完成，这是一种具有人工智能 (AI) 能力的分析管道。、 多种传统分割工具和人工智能技术的结合可实现针对特定实验的定制测量，这也可以用于高含量数据集。 如图 7A 所示，我们基于以下五个步骤创建了分析管道： 去噪、去卷积、阈值分割、数量统计和测量。 使用该程序可自动分析先前采集的高含量数据，获取关于体积 (um3)、表面积 (um2)、伸长率 (um)、球形度和直径 (um) 等信息，并使我们能够更深入地了解 3D 乳腺培养物的形态学特征（图 7B）。
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图 7： 用于 3D 乳腺培养腺泡形态学分析的自动高含量数据分析。 通过 GA3 分析 (A) 建立分析管道，以获取 3D 乳腺球体的体积、表面积、伸长率、球形度和直径 (B) 等信息。
我们使用这类自动分析管道收集了广泛的信息，这些信息将有助于理解突变 Ras 受体如何影响腺泡的增殖和形态。 如图 8A 所示，来自非恶性乳腺癌培养物的腺泡结构通常具有圆形对称形状。 另一方面，来自恶性乳腺癌培养物的腺泡会导致 3D 结构变形，这种变形会导致腺泡形状更拉长和解构。 值得注意的是，与对照细胞系相比，来自 MCF10A K-Ras 工程细胞系的球体具有显著的体积增加（图 8B）。 事实上，k-Ras 癌基因的转化作用与细胞增殖率增加相关，该转化作用导致球体体积在培养 6 天后有所增加。
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图 8： 代表性 MCF10A-CTR 和 MCF10A-RAS 腺泡 (A) 和体积分析 (um3) (B)。 在 3D 基质胶悬浮液中进行细胞培养并用中心粒周蛋白（红色）和 DAPI（蓝色）染色。本图像是用 CFI Plan Apochromat Lambda D 20 倍空气物镜（20 倍，尼康，0.8 数值孔径和 0.8 mm 工作距离）采集。 MCF10A-CTR 和 MCF10A-RAS 腺泡体积比较 (B)。
结论
本应用说明中描述的成像管道基于 CrestOptics X-Light V3 旋转盘，是高含量成像的可靠解决方案。 由于其在 25 mm 视场范围内具有均匀照明，因此 X-Light V3 能够对大量细胞进行成像，从而在短时间内获得可靠数据。 X-Light V3 具有市场上最高的旋转盘转速 (15K rpm)，在全 FOV 下的采集速度可超过 1000 fps，比最快的点扫描共焦采集快 10 倍以上。 高速、高切片和超大 FOV 使 X-Light V3 旋转盘共焦成为面向 HCI 以及在不影响图像质量情况下收集大量数据集的理想解决方案。
通过与具有自动采集和分析功能的软件搭配使用，这款强大的成像系统可对非恶性 (CTR) 与恶性 (K-Ras) 癌细胞进行形态学特征比较 通过研究体积、伸长、球形度、直径和表面积等形态学特征，我们发现恶性肿瘤球状体在增殖过程中会表现出细胞极性丧失，从而改变腺泡的结构和构造。 因此，3D 细胞模型是重建体外肿瘤病理现象的有用工具。 因此，高含量显微镜与 3D 细胞模型结合使用可极大地促进癌症研究，特别是在肿瘤相关分子的验证方面。
显微成像方法
本应用说明的所有采集均通过配备了 CrestOptics X-Light V3 旋转盘系统、Celesta 激光源 (Lumencore) 和具有 6.5 um 像素、29.4 mm 视场的 Kinetix sCMOS 相机 (Photometrics) 的尼康 Eclipse Ti2 显微镜进行。
图像通过 NIS-Elements 显微镜成像软件（尼康）的 JOBS 模块采集（图 3）。 腺泡结构的形态学研究是采用 NIS-Elements GA3（尼康）完成（图 7）。
在 3D 基质胶悬浮液中进行细胞培养，并在培养 3 天和 6 天后用中心粒蛋白、微管蛋白和 DAPI 染色。
致谢
本应用说明是由罗马 Consiglio Nazionale delle Ricerche 分子生物学与病理学研究所的 Giulia Fianco 博士与 Giulia Guarguaglini 博士合作设计。
本应用说明中所使用的细胞系由 Venturina Stagni 博士（国家研究委员会分子生物学与病理学研究所）和 Daniela Barilà 博士（圣卢西亚基金会，IRCSS；罗马第二大学生物系）慷慨提供。
参考文献
Martin, Katherine J 等人。 “从 3D 培养模型中识别的乳腺癌预后特征可准确地预测独立数据集的临床结局。” PloS 第 1 卷 3,8 e2994.2008 年 8 月 20 日，doi:10.1371/journal.pone.0002994
Weigelt、Britta 和 Mina J Bissell。 “揭示微环境对正常乳腺和乳腺癌的影响。” 《癌症生物学研讨会》第 18 卷，5 (2008): 311-21. doi:10.1016/j.semcancer.2008.03.013
