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结合共聚焦和超分辨率显微技术研究小胶质细胞微管重塑

根据最近发表于 Cell Reports 杂志的一项研究报告,M. Rosito 博士及其合作者们发现,在小胶质细胞中,稳态和反应态之间的过渡是以微管细胞骨架的戏剧性重组为特征的。在这项研究中,作者表明,激活的小胶质细胞提供了一个从平行和稳定的非中心体微管阵列到更动态的微管径向阵列的微管重组的例子。

这项工作中用到了为数众多的技术,且在本应用说明中,我们报告了 CrestOptics 转盘共聚焦 (CF) 和超分辨率 (SR) 系统是研究微管重塑和识别每种小胶质细胞功能状态典型的定义超微结构元素的基础。

 

要更完整地了解这项工作所获得的所有辉煌成果,请参阅完整论文。

小胶质细胞是中枢神经系统的初级免疫细胞。它们在稳态下表现出分支形态,并通过扩展和收缩其高度运动性的过程不断巡逻局部环境。在神经元炎症或损伤后,小胶质细胞的基因表达和形态发生巨大变化,从而表现出这种激活状态下典型的变形虫形状。细胞形态和对称性的变化与肌动蛋白和微管 (MT) 细胞骨架的广泛重组有关,所以,作者使用 CF 和 SR 显微镜揭示了 MT 细胞骨架的独特重排是小胶质细胞从稳态到反应态转变过程中形态学变化所必需的。

CF 免疫荧光分析显示,在稳态、激活和选择性激活的小胶质细胞中,MT 取向会有所不同。

为了研究 MT 细胞骨架在稳态和反应态下小胶质细胞中的组织,作者使用小鼠原代小胶质细胞培养物,其中,分支细胞(稳态小胶质细胞)的存在由星形胶质细胞分泌的生长因子维持。为了将小胶质细胞定向到不同的反应态,用脂多糖-干扰素-g (LPS-IFNγ) 刺激激活的小胶质细胞,或用白介素-4 (IL-4) 刺激选择性激活的小胶质细胞。

Rosito 等人假设,在小胶质细胞中,由 MT 锚定和定向重塑驱动的细胞极性的显著变化与从稳态表型到迁移反应态的转变平行。为了评估这一点,他们分析了 MT 正端结合(EB,积极生长 MT 正端的标记)和负端 CAMSAP(一种通过覆盖游离 MT 负端来调节非中心体 MT 阵列的形成和稳定性的蛋白质)标记在稳态、激活和选择性激活的小胶质细胞中的定位和表达(图 1)。

CF 免疫荧光分析结果显示,在激活和选择性激活的小胶质细胞中,EB1 修饰了大部分向细胞外围延伸的游离 MT 端,从而证实了存在一个显著的动态 MT 池,且其呈放射状排列,且负端附着在核周区域。

 

虽然在较小程度上,EB1 彗星在稳态小胶质细胞的 MT 端也清晰可见。此外,由于使用 CrestOptics 共聚焦转盘获得的高分辨率图像,EB 阳性彗星的荧光强度梯度分析证实了逆行彗星在稳态小胶质细胞和选择性激活的小胶质细胞中存在,而不是存在于激活的小胶质细胞中。

Confocal image

图 1:稳态 (Homeo)、激活 (LPS-IFNγ) 和选择性激活 (IL-4) 小胶质细胞中 EB1(洋红色)和酪氨酸化α-微管蛋白 (Tyr tub)(绿色)的代表性免疫荧光图像。Hoechst 代表细胞核可视化,蓝色。比例尺,20 um(缩放图像为 5 um)。

在稳态小胶质细胞中检测到逆行彗星,表明存在非中心体 MT 阵列,在此,作者通过分析内源性 CAMSAP2 的表达和分布来进行研究。在稳态和选择性激活的细胞中,CAMSAP2 在细胞分支中以簇状点的形式分布(图 2 和 3,箭头),而在激活的小胶质细胞中,仅在核周区域检测到胞质 CAMSAP2 染色。

此外,作者发现,虽然内源性 CAMSAP2 在稳态和选择性激活的细胞中以簇状点的形式分布在细胞分支中,但在激活的小胶质细胞中,细胞质 CAMSAP2 染色仅在核周区域周围检测到(图 2 和 3,箭头)。

Confocal image 2

图 2:具有代表性 z 投影 CF 图像显示了 Homeo-、LPS-IFNγ或 IL-4 处理的小胶质细胞中的 CAMSAP2(洋红色)和 Tyr tub(绿色)信号。Hoechst 代表细胞核可视化,蓝色。比例尺,20 um(缩放图像为 5 um)。

图 3:  在 Homeo-、LPS-IFNγ- 或 IL-4 处理的小胶质细胞中,CAMSAP2(洋红色)和 Tyr tub(绿色)信号在更高放大倍数下的单个 CF 平面。比例尺 5 um

这些数据表明,稳态和选择性激活的小胶质细胞都表现出混合 MT 极性模式,且激活表型的获得是 MT 细胞骨架重塑的一个独特例子,其从平行的非中心体到通过它们的负端锚定于核周围微管组织中心 (MTOC) 的 MT 径向阵列。

SR 显微镜显示激活的小胶质细胞中微管成核物质在核内体周围重新分布。

中心粒周围物质 (PCM) 的募集代表了巨噬细胞激活过程中的一个功能步骤。因此,Rosito 等人研究了γ-微管蛋白募集到核周围区域是否也是小胶质细胞激活的标记。

为了了解亚细胞细节和γ-微管蛋白亚细胞分布,作者使用了 CrestOptics 结构光照明显微成像 (SIM) 系统,并发现激活的小胶质细胞显示出多个γ-微管蛋白点定位于核周区域(图 4A)。

 

此外,对γ-微管蛋白小点数量的定量分析表明,激活的细胞有 3 个以上的小点(图 4B);与之相反,稳态和选择性激活的小胶质细胞只显示一个或两个γ-微管蛋白点。

B

图 4:(A) γ-微管蛋白 (γ-tub) 点(洋红色)和酪氨酸化α-微管蛋白(左;Tyr Tub,绿色)在激活的 (LPS-IFNγ) 小胶质细胞中的免疫标记(中)。Hoechst 代表细胞核可视化,蓝色。比例尺 5 um。右:通过结构光照明显微成像获得的 γ-tub 点(洋红色)的相对体积视图(上)和 3D 渲染(下)。(B) 条形图报告了在稳态 (Homeo)、激活 (LPS-IFNγ) 或选择性激活 (IL-4) 小胶质细胞中显示 1-2 个 γ-tub 点(白条)或 >3 个 γ-tub 点(黑条)的细胞百分比。数值以 3 个独立实验的平均值 ± SEM 表示。

如图 4 所示,使用 SIM 增强了对比度,提高了亚细胞细节的分辨率,从而能够正确地显示小胶质细胞骨架细节,并证明了激活的小胶质细胞中核周围微管组织中心成熟体的重要性。

结论

通过使用 CrestOptics CF 和 SR 系统,作者能够进行免疫荧光分析,以研究小胶质细胞激活如何影响微管细胞骨架重塑。

结果表明,在经典激活和选择性激活过程中,小胶质细胞 MT 变得更不稳定,更动态,这表明新细胞功能的获得调节了 MT 的稳定性。

此外,小胶质细胞激活导致γ-微管蛋白定位到中心体和新生 PCM 和 MTOC 成熟体周围的点的能力得到增强,从而为活体成像研究提供了一个小胶质细胞反应性的独特标记。

综上所述,CrestOptics 转盘 CF 和 SIM 的结合代表了一种强大的解决方案,可以提高图像分辨率,并获得必要的细胞细节,从而得以研究不同生理和病理背景下小胶质细胞形态和功能变化背后的细胞骨架变化。

方法

本应用说明中介绍的所有成果均为使用 CrestOptics 转盘和 SIM SR 系统演示得来。

如欲了解更多关于 CrestOptics 产品的信息,请访问我们的产品页面。

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