神经生物学样品的结构化照明显微法 (SIM)

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宽场 (WF) 和共聚焦 (CF) 显微成像技术对于研究细胞和组织的形态和动力学而言是充分的,但却往往不足以准确回答所有生物学问题。事实上,在 WF 和 CF 显微成像技术中,仍然不可获得亚细胞结构,并且还被衍射极限所隐藏。

获得更高水平的信息可能会有新的发现,在这方面,超分辨率 (SR) 显微术已经成为生命科学领域越来越受欢迎的强大工具,可以用来研究精细细胞结构和亚细胞成分及其动态过程。

这些类型的实验通常需要克服衍射极限,将 WF 显微法可获得的横向和轴向分辨率提高一倍。

在过去几年里,技术和应用的发展齐头并进,因此关于 SR 技术,或者显示 SR 在生命科学中的应用的论文发表数量呈指数级增长。然而,尽管这些技术具有巨大的潜力,但仍然存在与 SR 相关的主要限制,大多数与其成本和复杂性相关。由于存在一些负面的含义,包括特殊的样品制备、不良的深度渗透和高昂的成本,SR 在日常实验室生活中还没有达到常规应用。

出于这些原因,在 CrestOptics,我们正在努力使所有研究人员都能获得 SR,推进其科学发现的潜力,使他们的科研成果更上一层楼。

我们的最新产品 DeepSIM 就是专门为此用途开发的,它是首个基于结构化照明的 SR 模块,能与任何现有的带摄像头端口的立式或倒置显微镜兼容,使用方便,与 CF 显微镜类似,并使科学家能够获得关于其生物样品的深层数据。

特别值得一提的是,DeepSIM 基于多点结构照明系统,能够仔细观察细胞结构,XY 轴分辨率高达约 100 nm,并且可以使用高至 (60X-100X) 和低至 (20X-40X) 倍数的放大物镜获得超分辨率光学切片,Z 分辨率高达约 300 nm。

DeepSIM 旨在处理与 CF 显微成像技术使用的样品厚度相媲美的样品,在本“应用注释”中,我们将重点关注不同神经生物学样本在高放大倍数下的超分辨率深度成像。

清除样品的超分辨率成像

现代显微成像技术的目标之一是克服光衍射极限造成的障碍,以便在纳米尺度上观察生物结构。此外,由于组织的不均匀性导致光散射发生,因此在散射限制光穿透深度的厚样品中,实现这一目标甚至更加困难。

为了证明 DeepSIM 在不同样品深度的穿透深度和光通量方面的最优性能,我们比较了复杂生物结构中的 WF、CF 和 SR 图像。

图 1显示了具有表达 GFP 神经元的清除后小鼠脑切片(250 um 厚)的不同可视化结果。得益于不同显微成像方法间的简单快速切换,我们报告 WF、CF 转盘和 SR 采集的全局比较,涵盖 60 倍油物镜工作距离 (130 um) 允许的最大厚度(图 1A)。特别是,我们聚焦于树突棘,即沿着树突轴纳米大小的突起,证明 SR 模块的能力,即使在非常厚的样品中,也能沿着样品的整个深度均匀地增强这种精细生物结构的细节(图 1B)。有趣的是,我们从图 1A 所示的整个体积中提取了最深的 30 µm,如图 1C 的强度分布图所示,即使在很深的深度,也能有效保持 DeepSIM 增强树突棘等精细结构(图 1C)。

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图 1:(A) WF、CF 转盘和 DeepSIM SR 3D 体积视图的比较。(B) DeepSIM SR 采集的 3D 影片,130 um 厚度。(C) 用 CrestOptics X-Light V3 CF 转盘和 DeepSIM SR 系统在样品 100 µm 深度获取的树突棘的可视化和强度剖面比较。

这些图像表明,由于超分辨率光学切片的 Z 分辨率高达约 300 nm,DeepSIM 允许为大型 CF 采集增加更深层次的细节。事实上,DeepSIM 的设计是为了处理厚度与 CF 显微成像相当的样品,提供 50 µm Z 深度以上的超分辨率数据。这意味着唯一的限制由物镜的工作距离造成,并且可以从本地异构复杂样品中获得更有意义的数据。

常规制备样品的超分辨率成像

在未清除的样品中,主要生物成分,如蛋白质、脂质和水有不同的折射率,导致光在穿过组织时发生更大的散射。因此,光不容易深入到样品内,导致深度 SR 成像出现问题。

凭借 DeepSIM,我们能够在常规制备的厚样品中提供 SR,而不需要进行特殊样品制备过程,并且我们可以获得尺寸与常规 CF 显微镜成像相当的超分辨 3D 样品。

为此,我们测试了几个散射神经生物学样品,图 2 显示常规制备的具有表达 GFP 神经元的小鼠大脑样品(100 um 厚)的不同可视化。我们特别专注于树突棘,如图 2A 和 2B 很好地报告的那样,与 WF 和 CF 转盘数据相比,这些详细的突起在超分辨率图像中更容易发现,也更清晰。此外,该样品的超分辨率 3D 渲染(图 2C)表明,即使在样品内部 60 um 深处,也有可能看到这种纳米尺寸的突起。

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图 2:对常规制备的具有表达 GFP 神经元的小鼠脑样品 WF、CF 转盘和 DeepSIM SR 采集的比较。(A) 来自 Z 堆叠的最大强度投影;(B) 神经元结构细节和(C) 3D 体积视图,60 um 厚度。这些图像是通过 CrestOptics X-Light-V3 CF 转盘系统和 DeepSIM SR 附件获得的。

图 3 是具表达 GFP 小胶质细胞的小鼠大脑(250 um 厚)不同可视化,尽管存在在未清除组织中(不可避免)产生光散射的生物结构,但仍有可能在与 CF 显微镜通常达到的相当深度处进行采集,从而显著提高分辨率和图像质量(图 3A)。请参见图 3B 和 3C,其中,我们聚焦于一个特定的小胶质细胞。我们观察到了形态学特征,并且得益于 WF、CF 转盘和 SR 之间的快速方便切换,有可能增强精细细胞结构,否则难以详细观察到,因此我们建议将 DeepSIM 作为细胞形态学研究的有力工具。

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图 3:对常规制备的具表达 GFP 小胶质细胞的小鼠脑样品进行的 WF、CF 转盘和 DeepSIM SR 采集的比较。(A) 3D 体积视图,72 um 厚度,(B) 最大强度投影和(C) 显示单个小胶质细胞细节的正交视图。这些图像是通过 CrestOptics X-Light-V3 CF 转盘系统和 DeepSIM SR 附件获得的。

使用 DeepSIM 不仅限于固定标本,而且由于 时间分辨率 > 10fps (在 1024×1024 像素的视场中),以及光暴露和光毒性风险得到最大限度降低,DeepSIM 高速采集也允许将 SR 显微镜应用于 体内研究。

在图 4中,我们报告的是活转基因秀丽隐杆线虫的 CF 转盘和 SR 采集的比较结果,其中秀丽隐杆线虫表达遗传编码的荧光 Ca2+指示剂(绿色)和泛神经元标记物(红色)。将转基因线虫限制在微流体装置中,用乙酰胆碱受体特异性激动剂 1 mM 左旋咪唑致其麻痹。

简单固定,再加上 DeepSIM 的高速时间分辨率,足以在活体样品上实现超分辨率显微成像。特别是,我们报告了 3D 体积重建(图 4A),然后重点关注头部感觉神经元和中间神经元(图 4B),显著提高了与 CF 采集相关的分辨率和图像质量。

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图 4:活转基因秀丽隐杆线虫的 CF 转盘和 DeepSIM SR 采集比较,其中,秀丽隐杆线虫表达遗传编码的荧光 Ca2+指示剂(绿色)和泛神经元标记物(红色)。  (A) 3D 体积可视化,33.5 um厚度,和(B)显示头部神经元细节的 Z 堆叠的最大强度投影。这些图像是通过 CrestOptics X-Light-V3 CF 转盘系统和 DeepSIM SR 附件获得的。

综上所述,这些数据表明 DeepSIM 能够处理厚度与 CF 显微成像中通常使用的厚度相媲美的样品,提供 50 um 以上 Z 深度的超分辨率数据。这意味着可以使用常规制备方案从原生异构复杂样品中获得更有意义的数据。

从单通道到高分辨率快速多通道成像

多通道成像通常用于研究组织内不同细胞类型之间的相互作用。为此,我们将 DeepSIM 设计为在 400至 750 nm 全光谱范围内工作,以便在荧光团选择方面提供最大的灵活性,及在不发生光谱重叠的情况下提供最佳的多通道成像。

图 5 是总体积为 30 um 的小鼠脑组织切片,切片显示具有树突棘(黄色)、小胶质细胞(品红色)、星形胶质细胞(白色)和 DNA(青色)的神经元。这些图像表明,使用 DeepSIM 不仅可以轻松地从 WF 切换到 CF 和 SR 显微技术,而且使用 SR 也可以对常规染色的样品进行快速和深度的多色成像。此外,利用 CF 转盘系统的规格,我们还可以做得更多,使用双摄像头功能同时采集多个通道,加快采集速度。

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图 5:对常规制备的小鼠脑组织切片的 WF、CF 转盘和 DeepSIM SR 采集,切片显示具有树突棘(黄色)、小胶质细胞(洋红色)、星形胶质细胞(白色)和 DNA(青色)的神经元。(A) 来自 Z 叠加的最大强度投影和(B) DeepSIM SR 采集 的 3D 影片,30 um 厚度。这些图像是通过 CrestOptics X-Light-V3 CF 转盘系统和 DeepSIM SR 附件获得的。

总之,所有这些采集的数据共同证明了系统的可塑性。将 DeepSIM 与 CF 显微镜相结合,可以灵活选择关注区域,并轻松切换到 SR,以显示所需的亚细胞细节,一键点击就能将分辨率提高一倍。

我们认为,所有科学家都应该使用 SR,以推进研究进展。生物学利用 3D 技术,探索 SR 的所有三个维度以扩展发现潜力至关重要。

显微成像方法

本“应用注释”的所有采集都是通过配备 CrestOptics X-Light-V3 转盘系统的 Nikon Eclipse Ti2 显微镜进行的,该显微镜还配备 DeepSIM 超分辨率附件、LDI 激光照明器 (89 North) 和 6.5 um 像素(光学性质)的 Prime BSI Scientific CMOS (sCMOS) 摄像机。我们使用 CFI Plan Apo Lambda 60x 油目镜 (NA 1.4, WD 0.13) 并以 0.3 um Z 步长执行 Z 堆栈采集。

图 2 所示的小鼠大脑样品由 EMBL-Rome 的 Alvaro Crevenna 博士和 Emerald Perlas 博士提供。

图 3 所示的小鼠大脑样品由罗马大学神经科学系的 Davide Ragozzino 教授和 Laura Ferrucci Sapienza 博士提供。

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