合作人：来自英国剑桥市欣克斯顿惠康桑格研究所 (the Wellcome Sanger Institute) 的 Kwasi Kwakwa 博士和 Omer Bayraktar 博士。
空间生物技术正迅速发展，逐渐成为了深入了解组织及其细胞结构的有力工具。事实上，由于在转录组学分析方面具有通用性，空间解析的转录组学技术已被 Nature Methods 评为 2021 年度技术方法 (Marx., 2021)。
空间生物学的主要目标是创建整个组织的综合基因表达图谱，它能通过细胞分辨率研究整个组织的结构和功能；这也是癌症研究、神经科学和发育生物学实验室采用此方法在空间环境中量化 mRNAs 的原因所在 (Marx, 2021)。
空间解析的转录组学分析可使用原位测序或多重荧光原位杂交来进行。在使用单分子荧光原位杂交 (smFISH) 之后，自动化高清成像可在特定细胞环境中，或在更大规模的整个组织中将基因表达图谱可视化。
这些研究中的关键点是成像步骤的复杂性，涉及对样品的大规模扫描和复杂的多维采集，包括 Z-stack 和单细胞分辨率多通道成像。为了支持这种复杂的采集，需要一个能够在短时间内完整地采集样品的装置，而不必降低图像的分辨率。
在这些类型的实验中，宽场成像模式通常用于增加通量并防止采集时间过长。然而，这种方法无法获得此类分辨率来正确定位细胞区室中的单个 RNA 分子表达，或在光学密集的组织区域分辨单个 RNA 分子。因此，在这篇应用说明中，我们介绍了一种基于 CrestOptics 共焦技术的高速四相机装置，Wellcome Sanger 研究所的 Bayraktar 博士团队将其应用于空间转录组学分析中。
Bayraktar 博士与其合作者共同开发并优化了一个大规模的空间转录组学管道，包括自动多路复用 smFISH、自动高清成像、单细胞和 RNA 斑点分割、单细胞基因表达分析及映射。为了完成这类研究所需的复杂成像步骤，实验室采用了最高速的 CrestOptics 解决方案，包括配备四台相机的 X-Light V3 转盘共焦系统（图 1）。
图 1：用于空间转录组学分析的高速四相机装置（安装于 Wellcome Sanger 研究所）。
这种高级装置包括一台配备尼康 40X 1.15 NA 水浸物镜的 openFrame 倒置显微镜 (Cairn Research)、一个 X-Light V3 转盘共焦模块 (CrestOptics)、四台 Kinetix sCMOS 相机 (Photometrics) 以及一个 LDI 激光源 (89 North)；整个系统由 MicroManager 软件控制，这可使相机同步并获得同步成像。
使用此高速系统对神经元亚型进行原位映射（图 2）。X-Light V3 转盘共焦在整个 25 mm 的视场 (FOV) 上提供均匀照明，可无缝拼接这个大型的样品，同时减少拼贴量并提升速度。此外，四台相机可在超大视场上同时捕捉多达四个通道，这进一步减少了成像时间。
另外，为这种应用选择最合适的旋转盘模式也进一步强化了此装置。旋转盘盒是 CrestOptics X-light V3 旋转盘共焦中最常用的部件之一，它可以根据应用和成像要求自由选择最适合的旋转盘几何形状。事实上，我们的客户使用了带狭缝（HT 狭缝）的旋转盘，即包含连续螺旋而非针孔的旋转盘，专为需要高通量、高速度和低激励功率的样品而设计。HT 狭缝旋转盘采用独特设计，旨在实现通量和共焦之间的平衡（请参阅我们之前的应用说明“空间转录组学：绘制脑细胞组织图”），使客户能在短时间内获得针孔旋转盘相关的复杂图像，因此与标准共焦相比，加速了实验的进程。
图 2 展示了如何将该装置应用于用不同种 RNA 标记的小鼠大脑部分。
图 2：用不同种 RNA 标记的小鼠大脑部分大图；细胞核被染成了蓝色。
特别的是，该图像通过一台 40X 1.15 NA 的水浸物镜获取，其最大强度投影为 15 um (1um Z-step)。整个小鼠大脑部分由一小时内获取的 300 个拼贴覆盖，同时考虑了 3D 和 2D 信息。
注意的是，尽管样品量很大，但使用这种高速装置也能让客户使用高倍率的数值孔径物镜。图 3 说明了该方法是如何提供关于组织分隔、细胞定量和相互作用研究的详细信息。
图 3：海马区的单点和 RNA 分子定位显示了 4 种不同 RNA 的原位杂交；细胞核被染成了蓝色。
总而言之，这种基于 CrestOptics X-light V3 共焦的高速四相机装置为空间转录组学分析提供了有力的解决方案。由于 X-Light V3 可在 25 mm 的视场提供均匀照明，因此能轻松缝合大型样品的图像，收集无伪影的数据，且能加速数据收集进程。HT 狭缝旋转盘特别适合此类应用，因其几何构造能确保具有更多的通量（通常为针孔旋转盘的三到四倍），同时保持非过厚样品 (< 30 um) 的良好轴向分辨率。此外，由于装置配备了四台相机，采集速度也因此提升了四倍，使得该解决方案尤其适合高速采集单细胞分辨率下的组织。
这些特点使该装置成为了 Wellcome Sanger 研究院空间生物学研究的前沿参考重点。
致谢：
对 Kwakwa 博士和 Bayraktar 博士为创建此应用说明所提供的支持以及对 Cairn Research 在 Wellcome Sanger 研究所作出的出色安装工作和客户支持工作，我们深表感谢。
