梦想实现:通过共聚焦显微镜进行长期酵母成像

酿酒酵母是使用最广泛的真核模式生物体之一,因为与动物模型相比,它在单倍体和二倍体形式上易于操作,并且生长迅速。酿酒酵母已用于研究细胞周期、凋亡、衰老、代谢、信号转导、迁移和许多其他生物学过程。在大多数情况下,酵母一直是这些路径最初被识别和研究的模式生物体。

分子生物学和病理学研究所(IBPM-CNR,位于罗马大学),Patrizia Filetici博士和她的合作者Manuela Leo博士利用酿酒酵母探索细胞周期的各个方面,从调节细胞分裂的机制到参与不同生理过程的亚细胞结构和细胞器,例如在三元噬细胞。

我们在此报告从Patrizia Filetici博士在一种特殊的酿酒酵母菌株中运用CrestOptics X-Light V3 共聚焦旋转盘获得的结果,并对位于线粒体和细胞质的荧光蛋白进行编码。特别是,我们使用的菌株显示一种含绿色荧光蛋白(GFP) 标签的蛋白和一种含MCherry(红色荧光蛋白)标签的蛋白。我们执行具有高放大率的三維堆栈和延时成像(尼康 Plan Apo Lambda60x Oil, NA 1.4系列物镜),以便准确评估随着时间变化的蛋白定位和荧光稳定性。

1A中,我们显示采用全视野视景(1608×1608 像素,相机光度测量 95B)获得的最大强度投影(MIP),通过增强查找表,您可以欣赏大量被捕获的细胞。此外,在1B中,通过高级去噪算法(尼康 Nis Elements 软件提供的工具)处理的感兴趣区域详细3D体积视图,使我们能够欣赏线粒体和细胞质中的细胞定位。在图2A中,我们报告了每30秒获取的延时成像3D影片(感兴趣区域 500×250 像素),以全摄影芯片在两个通道(GFP、mCherry)和沿Z轴(0.3微米Z步长,总厚度为8.7微米)上运行约30分钟。这个实时实验的目的是描述随着时间变化的荧光稳定性。我们测量了感兴趣细胞(选择了7个区域)的荧光强度,并清楚地观察到稳定的强度分布(2B)。

考虑到各个方面,都跟一直认为酵母是很难通过荧光共聚焦显微镜看到的相反,在这里我们证明了使用我们的X-Light V3旋转盘是可以看到从酿酒酵母内部显示的荧光蛋白。此外,在进行延时实验期间,细胞的健康得到保护和避免了荧光漂白。

图1:通过共聚焦旋转盘采集的酵母Z堆栈图像  

三维视图(顶部:最大强度投影混合;底部:透明度混合

图2:通过共聚焦旋转盘采集的酵母延时图像 

荧光蛋白强度分布

FigureB_Roi

最后,从酵母到人类控制真核细胞生物学关键方面的基本途径,都经过相关的调节器保护。值得一提的是,多达30%与人类疾病有关的基因都保存了酵母中的直向同源物。这些和分子遗传学的许多草案都解释了酵母作为人类疾病的模式生物体在理解癌症调控机制和神经退化疾病中所起的相关作用

此应用注释由Patrizia Filetici与Manuela Leo合作编写

分子生物学和病理学研究所 – 位于罗马大学的国家研究委员会

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