果蝇睾丸全标本包埋

黑腹果蝇是一种强大的模型系统,广泛用于阐明多种生物学过程。例如,果蝇雌性和雄性生殖细胞系的使用在很大程度上有助于理解细胞分裂和干细胞生物学的潜在机制。

罗马分子生物学和病理学研究所 (IBPM-CNR) 的 Maria Grazia Giansanti 博士小组利用全标本包埋程序对果蝇睾丸进行了解剖和免疫荧光分析。按照 Sechi et al.,2019 所述方案,在 PBS 中分离成熟果蝇睾丸,并将其固定在冰冷甲醇 (5 分钟) 和冰冷丙酮 (2 分钟) 中。我们在这里特别展示了透化睾丸,用含 0.1% Triton X-100 和 3% BSA 的 PBS 封闭,然后进行 α-微管蛋白(二抗:FITC)和 Cyclin B(二抗: Alexa Fluor-647)染色。用 DAPI 进行 DNA 染色后,用 ProLong Glass Antifade (Invitrogen) 对样本封片。

使用 CrestOptics X-Light V3 共聚焦旋转盘来采集果蝇睾丸的图像。使用的显微镜设置配备了 Eclipse Ti2 显微镜 (Nikon)、Celesta 激光源 (Lumencor) 和 Prime 95B sCMOS 相机 (Photometrics)。为了清楚显现整个器官,我们比较了使用 20 倍空气物镜(0.75 NA,1 mm WD) 和 40 倍硅油物镜(1.25 NA,300 µm WD, Nikon 惠赠)采集的图像结果。在图 1 中,我们报告了两次采集图像,并强调与 20 倍空气物镜相比,40 倍硅油物镜采集的小亚细胞结构图像明显具有更高的分辨率和清晰度(见缩放区域)。为了更好地了解睾丸内部的 3D 细胞组织,我们还在 3D 体积视图和影片中展示了整个器官(图 2)。

为获取高分辨率的详细视图,我们进一步使用了 100 倍油物镜 (1.49 NA, TIRF 120 µm WD) 并运行了 Z 堆栈采集。由于睾丸存在不同的精子发生阶段,因此我们重点关注两个目标区域。内扭曲区含有成熟的精子尾部,而精原细胞和精母细胞占睾丸分泌精液的前三分之一。这两个细胞区域均显示在 2D、3D 体积视图中,外部区域则显示在 3D 渲染影片中(图 3)

Sechi et al.,2019 所述,全标本包埋技术可应用于雄性果蝇突变体中减数分裂和精子发生的分析,可用于检测中心粒分离、纺锤体组织、染色体分离和胞质分裂的缺陷。此外,G2/M 转换的正确时间对于适当的减数分裂进程至关重要,因此对于精母细胞成熟也至关重要。在减数分裂调节因子中,值得一提的是细胞周期蛋白 B,其可控制完成减数分裂前期的 G2/M 的正确时间 (Baker et al.,2015)。在这里,我们强调了细胞周期蛋白 B 在整个睾丸的分布情况(图 1、2),更具体地说是在单细胞水平下(图 3)。总之,这些数据能够在全标本包埋睾丸中以高分辨率显示蛋白质,并能够根据科学需要进行定量分析(例如,定位和荧光强度测量)。

图 1:使用 X-Light V3 共聚焦旋转盘进行完整睾丸采集。图中显示了 Z 堆栈的去噪最大强度投影 (MIP)(α-微管蛋白(青色)、细胞周期蛋白 B(品红色)和 DNA(白色))。比例尺,100 µm。

20 倍空气物镜

40 倍硅油物镜

图 2:使用 X-Light V3 共聚焦旋转盘和 40 倍硅油物镜采集完整睾丸。图中显示了去卷积图像的 3D 视图和影片(α-微管蛋白(绿色)、细胞周期蛋白 B(青色)和 DNA(白色))。

3D 体积视图

影片

图 3:使用 X-Light V3 共聚焦旋转盘和 100 倍油物镜采集的目标区域。比例尺,50 µm。

内部区域:MIP、3D 视图、正交视图

外部区域:MIP、3D 视图、正交视图

外部区域:影片

本应用注释是与 Anna Frappaolo 博士、Stefano Sechi 博士、Angela Karimpour Ghahnavieh 博士和 Maria Grazia Giansanti 博士合作编写。

分子生物学和病理学研究所 (IBPM-Consiglio Nazionale delle Ricerche; Rome)

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