旋转盘安装原则

关于每个共聚焦显微镜设置的其中一个很基本的一般性问题是:哪些是以最佳方式组合光学模块的关键步骤,如果出现故障,会出现哪些问题? 我们将在此简要说明对这种模块的设计、安装和对准提供指导的标准,为什么这些步骤对提供高质量的图像很重要,以及整个过程是多么简单轻松。

流程的简易性和稳定性

安装这些系统的指导原则是:简易性、速度、效率、稳定性。 安装时仅需花费很短的时间(< 1 小时)即可轻松对准,而且机器可以实现名义效率。 对准的 3 个关键步骤是
  1. 共聚焦旋转盘模块的内部对准
  2. 对准显微镜
  3. 旋转盘针孔与相机的共轭

内部对准

这种对准的重要性在于必须确保从光纤的照明轴到共聚焦单元的输出光轴的对准。 因此,激发光将以正确的角度照射到滤光片、旋转盘和显微镜的光学器件上,从而通过显微镜的光通量将达到最大化。

CrestOptics 旋转盘装置

这样一来,旋转盘共聚焦装置就可以随时与任何其他光学系统耦合。 CrestOptics 装置的其中一个特点是,它们在出厂时就已经进行了内部预对准,并且在装置的整个使用寿命期间保持对准,不需要技术人员进行定期校正。因此保证了稳定性。

对准显微镜

每个显微镜都是一个拥有自己光轴的光学系统。当旋转盘装置与之结合时,旋转盘的输出光轴必须与显微镜的光轴对准。 通过将照明光束相对于安装在物镜位置即后孔处的目标进行居中来实现这一目标。 通过使用简单的工具,即可在很短的时间内调整照明光束并使其居中。
图 1:物镜后孔处中心照明光束照片 (X-Light V3)
从下图可以看出,采用居中和偏离中心的照明光束获取的图像之间的差异:当照明光束偏离中心时,强度水平可能比最佳值低 50%(或更低)。
图 2:A) 采用偏心的光束成像; B) 同一视场,照明光束正确居中

旋转盘针孔与相机

从旋转盘显微镜原理的角度来看,最后一步是最重要的,就是要保证旋转盘针孔和相机探测器在光学上相互“共轭”。根据结构,旋转盘被放置在一个与样品平面共轭的平面上(在倒置显微镜的侧面端口或在正置显微镜的顶部端口)。 给定平面 P 的共轭平面 P’ 是指 P 上的物体在 P’ 上成像的平面。
通过这种方式,旋转盘让来自物镜焦平面的光线通过,并拒绝来自样品大部分(离焦平面)的不想要的光线。相机探测器与旋转盘针孔共轭,收集来自旋转盘过滤层的所有所需光线,从而提高最终的轴向分辨率。 从下图可以看出采用错误的针孔聚焦和正确的针孔聚焦获得的图像之间的差异:
图 3:A) 未正确设置针孔焦点的图像; B) 相同的视野,但在这种情况下,针孔焦点设置正确。

让我们来总结一下主要步骤的结果

  1. 当照明光束正确地对准显微镜时,强度水平最佳,意味着样品被均匀地照亮,可以从图像中提取定量的数据。
  2. 当针孔正确聚焦时,图像就会很清晰,并达到最佳共聚焦分辨率。
图 4:使用 40 倍水物镜,在全旋转盘分辨率下的视网膜神经节细胞。
图 5:使用 40 倍硅物镜,在全旋转盘分辨率下的果蝇图像

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