抗肺炎克雷伯菌单克隆抗体结合模式的可视化

托斯卡纳生命科学基金会 (TLS)是一家总部位于锡耶纳(意大利)的非营利组织,支持生命科学领域的研究活动,从基础研究到工业应用。在他们的项目中,TLS 的单克隆抗体发现 (MAD) 实验室专注于鉴定和生产单克隆抗体 (mAbs),作为对抗细菌和病毒的新疗法。与标准药物相比,mAbs 具有多种优势:例如,它们的特异性、耐药性发展的风险有限以及与抗生素协同作用的能力。此外,mAbs 有助于确定疫苗靶点并加速疫苗开发,因此是抗击传染病的绝佳工具

mAbs 研究领域的一个相关方面是验证抗体与细菌表面的结合效率。这里,我们展示了在 TLS 分离的与表达 mCherry 的肺炎克雷伯菌结合的 488 荧光团偶联 mAb 的数据。采用 CrestOptics X-Light V3 共聚焦转盘系统结合 DeepSIM 超分辨率附加组件、Celesta 激光源 (Lumencor) 和 sCMOS Prime BSI 相机(Photometrics,6.5 μm 像素尺寸)进行捕获。我们采用了 100x 油浸物镜(尼康,1.45 NA)并沿细菌体积(0.1μm Z 步长)进行 Z-堆栈捕获。

1 中们展示了采用 CrestOptics X-Light V3 共聚焦转盘捕获的细菌细胞 Z 堆栈的最大强度投影 (MIP)。为了更准确地识别细菌表面上的 mAb 结合模式,我们采用 X-Light V3 转盘的 DeepSIM 超分辨率附加组件对进行分析,并将细菌可视化为三维体。DeepSIM 超分辨率模块可轻松集成到现有显微镜系统中,使用常规样品制备方案提供复杂生物标本的结构化定位成像。在图 2 中,我们通过展示三维体视图和突出显示仅在超分辨率图像中可见的细胞细节,特别是关于 mAb 染色(绿色),显示了共聚焦转盘和超分辨率捕获之间的对比。

为了演示 CrestOptics DeepSIM 如何比传统显微镜获得显著收益,我们报告了从宽场到共聚焦转盘再到超分辨率捕获的不同显微镜方法的全局比较(图 3-4)。值得注意的是,与宽场、原始和去积转盘数据相比,单克隆抗体的 3D 组织、聚集体的交替、甚至细小的突起在超分辨率图像中都可以检测到,并且肯定更清晰。

总体而言,筛选抗体和细菌之间的结合质量和效率是一个非常适合转盘显微镜的生物学例子。选择了有前景的抗体后,在相同设置配置下轻松切换到超分辨率显微镜的可能性有助于研究人员深化数据,并做出进一步的生物学考虑。配有 DeepSIM 模块的 CrestOptics X-Light V3 转盘配置是满足每一种科学需求的完美解决方案,这些科学需求需要在实验方案的特定步骤增强分辨率,而无需移动到不同的显微镜。

图 1:采用 CrestOptics X-Light V3 转盘捕获的细菌细胞 MIP 图像。488 荧光团偶联的 mAb 显示为绿色,细胞质的 mCherry 显示为红色。

图 2:关注区域的三维体视图,显示了采用 CrestOptics X-Light V3 转盘 (SD) 和 DeepSIM 超分辨率 (SR) 系统捕获的细菌细胞。488 荧光团偶联的 mAb 显示为绿色,细胞质的 mCherry 显示为红色。箭头表示仅在 SR 图像中可见的结构细节示例。从 65 幅原始图像开始处理 SR 图像,这些图像是通过联合 Richardson-Lucy (jRL) 算法的修改版本,使用多焦点结构光照明获得的。

图 3:单一 Z 平面图,显示采用 CrestOptics X-Light V3 系统 以不同方式(宽场,WF;转盘,SD;由 NIS Elements 软件提供的 3D Richardson-Lucy 算法 (20 ite) 解卷积 SD;DeepSIM 超分辨率,SR)捕获的 mAb 染色(绿色)。箭头表示只有通过提高图像分辨率才可见的结构细节。

WF

SD

dec SD

SR

图 4:DeepSIM 超分辨率 (SR) 图像的三维体视图和电影。

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