将目光投向红外:神经元模型系统中的近红外荧光

在罗马的纳米生命科学中心(Center for Life Nano Science,CLNS@Sapienza–意大利理工学院),Silvia Di Angelantonio 教授正在研究主要的人类神经退行性疾病,例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症,以确定可能会在需要治疗疾病进展的医学领域推动新药开发的生物标志物。Di Angelantonio 的团队利用不同的人体模型系统,从死后视网膜组织到体外神经元培养,来研究这种神经退行性过程的分子基础。

更具体地说,我们在这里展示了死后人视网膜(第 1 部分)和人 iPSC 衍生的皮质神经元(第 2 部分)样本,两者均染有 DAPI 和微管蛋白(二抗:Alexa 750)。我们使用了与 Celesta 激光器 (Lumencor) 耦合的 CrestOptics X-Light V2 spinning disk confocal,其光谱线宽为 405 nm 至 749 nm。尽管大多数荧光团在光谱的可见光或紫外光部分工作,但近红外 (NIR) 荧光是一种波长为 650–950 nm 的光,这种近红外荧光有望用于检测和成像。近红外染料,例如 Alexa 750 荧光团,使研究人员能够拓宽同一样本内荧光标记物的范围,并代表 DAPI/GFP/RFP/Cy5 常用集的有效附加通道。此外,由于其光学特性,近红外光可穿透至更深的深度,并且由于其良好的组织穿透性和低自体荧光,通常优选用于厚标本中的体内荧光和深度成像。

第 1 部分:死后人视网膜组织

我们报告了使用 Prime 95B 相机(11 um 像素大小;光度测定法)获得的视网膜组织(切片厚度 5 um)的采集结果,以突出显示三原胚层的细胞组织:通过细胞核染色识别的外部感光层 (i) 和双极细胞层 (ii),以及通过细胞核和微管蛋白染色识别的内部神经节细胞层 (iii)(图 1)。除此之外,我们还显示了 2D 视网膜的详细部分 [作为单个 Z 平面和 Z 堆栈的最大强度投影 (MIP)] 和 3D 体积渲染(图 2)。我们将原始旋转盘采集与后期处理细化 [即,在尼康 NIS Element Software 中提供的 Advanced Denoising (AdDen) 工具] 进行了比较,并指出平滑处理如何改善亚细胞结构表面,特别是对于细胞核而言非常明显(请参见用于量化的强度分布图)。

 

图 1:两个不同的视网膜区;20 倍空气物镜;DNA(蓝绿色)和 Tubulin-750(红色)。

图 2:原始旋转盘图像与使用 Advanced Denoising (AdDen) 工具处理的图像之间的比较;60 倍油物镜。

原始

AdDen

一个 Z 平面

MIP

体积视图

强度分布图

原始

AdDen

第 2 部分:来自人类诱导多能干细胞的皮质神经元

皮质神经元是通过能够诱导多能干细胞分化为兴奋性皮质神经元的主基因的过度表达产生,并在培养 15 天后收集。我们在这里展示了神经元的大视图采集(图 3)和感兴趣区域(图 4),两个视图均使用 BSI 相机(6.5 um 像素大小;光度测定法)获得。通过奈奎斯特抽样定理,可以推断出 60 倍物镜放大率与约 6.0 um 的相机像素大小适当匹配。因此,我们运行了去卷积处理来研究神经元图像的差分质量改善。我们单独或组合执行了 Advanced Denoising (AdDen) 和反卷积算法(Dec;由尼康 NIS Element Software 提供),并且强调值得使用尝试不同的后处理程序,以根据实验需要确定哪种方法对特定的亚细胞结构具有主要益处(例如平滑边缘、提高分辨率)(具体参见用于量化的强度分布图)。

 

图 3:皮质神经元的大视图;20 倍空气物镜;Tubulin-750(红色)和 Map2-488(白色)。

图 4:原始旋转磁盘图像与使用 Advanced Denoising (AdDen) 和去卷积 (Dec) 算法处理的图像之间的比较;DNA(蓝绿色),Tubulin-750(红色)和 Map2-488(白色);60 倍油物镜。

原始

AdDen

Dec

一个 Z 平面

MIP

体积视图

强度分布图

Raw

本应用程序说明与 Rocco Pizzarelli 博士Alessandro Soloperto 博士 Silvia Di Angelantonioro 教授合作编写

Center for Life Nano Science (CLNS@Sapienza  Italian Institute of Technology), Rome

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