将旋转盘模式与应用程序相匹配

简介

旋转盘在提高传统荧光显微镜的分辨率和对比度方面的有效作用,仅与两个几何特性明显有关。这些特性是:针孔大小 (D) 和针孔之间的间距 (S)。 可以立即推断出,通过改变这些参数,可以得到不同的结果。
图 1:旋转盘示意图插图中显示的针孔直径 (D) 和间距 (S)

针孔大小

一个重要的关系是给定物镜的“Airy 单位”与针孔大小之间的关系。 物镜的 Airy 单位是衡量物镜分辨率的标准,主要取决于在相同波长下的放大率 (M) 和数值孔径 (NA)。 旋转盘针孔直径与 Airy 单位之间的比率可用作简单且极具参考价值的数据,以确保使用的旋转盘模式适用于特定设置。这种比率通常在 1 到 2 之间:
事实上,在这个范围内,与宽场相比,轴向分辨率(或共聚焦性)有很大的改善,同时,与系统的通量有良好的权衡,这意味着可以从标本中收集足够水平的光线,因此在采集中可以实现高速和低光毒性。 对于比率 < 1的情况,共聚焦性最大化,但通量会降低。这种情况对大多数应用来说是不可接受的,因此它没有被列为商业旋转盘系统的标准选择。 对于比率 >>2 的情况,通量有所提高,但共聚焦性受到较大影响,无法带来真正的好处。

针孔间距

如果理想情况下,所有的样品都是薄而稀疏的,那么所产生的分辨率将主要受限于上面关于针孔直径的考虑事项。  在现实中,在显微镜下分析的每个样品都是一个三维样品,其特点是具有不同性质和不同密度的多个层次。 由此产生的效果是:如果相对于试样的厚度/密度而言,针孔之间的距离太近,则来自远处焦平面的光线将同时通过几个相邻的针孔。这种效应称为针孔串扰。  串扰会影响轴向分辨率(即使在针孔直径本身是最佳的情况下),因为通过相邻针孔的光线有助于形成来自试样错误点(本应被拒绝的远处点,见下图 2)的图像。 所以重要的是在试样较厚的情况下,要确认选择的针孔间距。
图 2:旋转盘成像中的串扰表示如果针孔相对于试样厚度而言彼此过于接近,那么失焦的作用就变得很重要

标准和自定义旋转盘

下表显示了旋转盘中使用的标准针孔直径和间距:

典型值

针孔直径

50µm 25µm

狭缝孔径

50µm

典型值

间距

250µm 400µm 500µm
大多数商业系统在旋转盘模式方面仅提供有限的选择,而 CrestOptics 提供了完全定制旋转盘几何形状的可能性,可为相关应用定制旋转盘。例如:
  • 可以有一个带有狭缝的旋转盘(即连续螺旋而不是针孔,请参阅“匹配您的样品”段落)。
  • 根据用户的要求,在对具体项目进行仔细评估后,有可能实现不同的针孔直径和间距。
  • 通过使用多模式旋转盘或切换旋转盘盒,可以轻松地在同一设置上的不同模式之间切换
图 3:具有不同旋转盘、针孔和狭缝的旋转盘盒视图

匹配物镜和旋转盘模式:典型用例

我们在此回顾 3 个典型用例和推荐的旋转盘特性
Case 1

应用

物镜

建议的针孔大小

高倍率,

高分辨率

100x, NA>1.3, 油浸 50um
60x/63x, NA>1.3, 油浸
Case 2

应用

Plan Apo 物镜 建议的针孔大小
适用范围广的设备 100x, NA>1.3, 油浸 50um
60x/63x, NA>1.3, 油浸
40x, NA>0.9, Dry
20x, NA>0.7, Dry
Case 3
应用 Plan Apo 物镜 建议的针孔大小

低倍率,

低分辨率

20x, NA>0.7, 干燥 25um
10x, NA>0.4, 干燥
4x, NA>0.2, 干燥
注意:在第 1 和第 3 种特定情况下,针孔大小和物镜属性之间有一个相应的匹配,而在第 2 种情况下,为了简化设置的使用,建议进行小幅折衷。这种折衷被广泛接受。

匹配您的样品

旋转盘共聚焦用于对各种标本进行成像:  薄或厚、疏或密、高散射或透明等…… 因此,了解针孔间距对成像性能的影响至关重要,这种影响取决于样品的特性,我们在下面的三个主要使用情况中进行区分。 在我们的讨论中,当我们提到标准间距时,是指通常比针孔直径大 5 倍的间距,而较大的间距是指比标准间距大 1.5/2 倍的间距。
  • 单层细胞或薄组织切片(2-20 微米)。在这种情况下,具有标准间距的针孔是达到最佳效果的完美选择。在样品非常暗淡的情况下,使用狭缝可能是有利的。这样会增加通量(通常是针孔的 3-4 倍),但共聚焦性会受到影像,但无论如何,通常比宽场好 20%-25%(与针孔旋转盘提供的 40% 改进相比)。同一旋转盘上的针孔和狭缝的组合使用户可以在需要时在这两种采集模式之间自动切换,所以这在一定程度上代表了系统可用于多种应用的优势。
  • 厚组织切片 (20-200) 或散射组织。在这些情况下,有一个间距较大的旋转盘是非常重要的,以改善对失焦的抑制。较大的间距会影响系统的通量。这意味着这种旋转盘对于暗淡的样品来说不是最佳选择。
  • 稠密的澄清组织。在这种情况下尽管厚度很大(通常 > 400um),但组织的散射水平很低,因此可以使用标准间距。

A

figure 4a

B

figure 4b

C

figure-4c
图 4: a) 在具有标准间距的左旋转盘上,b) 在中心相同的大间距针孔中,c) 在具有狭缝的右旋转盘上 
为了了解这些论点,让我们看看下面这些使用不同旋转盘采集的图像。 A. 充满荧光染料的纳米纤维。使用 60x NA 1.4 油浸式物镜获得的厚度。这些结构很厚且高度散射。
图 5:a) 在左侧,通过采用标准间距的旋转盘获取的 3D 重建,b) 在右侧,通过采用间距为标准间距两倍的旋转盘获取的 3D 重建(样品由乌特勒支大学化学系 Martin Haase 提供(荷兰))
图 6:XZ 和 YZ 投影 a) 左侧为具有标准间距的旋转盘,b) 右侧为具有标准间距两倍的间距的旋转盘。(样品由乌特勒支大学化学系 Martin Haase 提供(荷兰))
B. 荧光珠。  嵌入荧光素溶液中的厚多层硅珠阵列(直径)。采用 Plan Apo λ 60x 油收集基底层。很明显,当使用较大间距的旋转盘获取散射介质时,对比度会增加。
图 7:a) 在左侧,通过采用标准间距的旋转盘获取的单一平面, b) 在右侧,通过采用间距为标准间距两倍的旋转盘获取的单一平面。
C. 澄清组织。厚组织。使用 25x NA 1.05 硅物镜以双色 GFP/CY5 成像。 宽场和共聚焦之间的比较表明,标准间距保证了最佳对比度。
图 8:250 微米堆叠的最大投影:  a) 在左侧宽场采集, b) 在右侧以标准间距进行共聚焦采集。
图 9:3D 体积 a) 在左侧宽场采集, b) 在右侧以标准间距进行共聚焦采集。
在下表中,我们总结了通过讨论得出的注意事项:
直径 共聚焦性 通量
大直径 +
小直径 +
间距 共聚焦性 通量
+
+

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