在培养皿中研究人类神经发育:研究脆性 X 综合征的 2D 和 3D 脑模型

最近发表在《细胞死亡与疾病》的一项研究(Brighi 等人,2021 年)由生命纳米与神经科学中心和罗马大学成立的联合实验室(CL2NS@Sapienza – 意大利技术研究院)的 Silvia Di Angelantonio 教授和 Alessandro Rosa 教授合作完成。在此项研究中,已建立了新颖的人类 2D 和 3D 脑模型,可重现与脆性 X 综合征 (FXS) 相关的一些神经生物学表型。在这项研究中,作者展示了利用人脑类器官研究 FXS 的可能性,首次提出利用此实验平台在人类遗传背景下模拟 FXS。

FXS 是一种遗传性神经发育障碍,由 FMR1 基因的表观遗传沉默和随之而来的脆性 X 智力低下蛋白 (FMRP) 缺失引起。

在 FXS 患者中,发育大脑中树突棘形态、突触形成和连接的改变会导致认知障碍、沟通缺陷、多动和焦虑。

多年来,已有多种动物模型用于 FXS 及其机制的研究。然而,尽管 FXS 动物模型(特别是 Fmr1 KO 小鼠)是理解此病理学固有不同机制的基本资源,但生理和进化差异阻碍了这些结果从动物向人类转化。由于这些原因,作者建立了一个基于同基因突变体 (FMRP-KO) 和对照 (FMRP-WT) 人诱导多能干细胞 (hiPSC) 系的体外 FXS 模型系统,并表明与疾病相关的 hiPSC 生成的进展以及通过基因组编辑进行修饰,为 FXS 疾病建模提供了新的可能性。

在这项研究中,首先使用 2D 培养条件将这些细胞系分化为皮质神经元,且由于皮质过度兴奋是 FXS 的标志之一,所以作者通过免疫荧光信号的共聚焦分析表征了谷氨酸能和 GABA 能系统的发育。为此,在 Brighi 等人的研究中使用 CrestOptics X-Light V3 转盘来获取图像,以研究谷氨酸能和 GABA 能突触成分的存在和适当的形成条件。因此,FMRP-WT 和 FMRP-KO 培养物的并排比较显示,FMRP-KO 神经元在第 54 天表现出更多数量的突触前 (VGLUT1) 和突触后 (PSD95) 谷氨酸能成分,这表明体外成熟过程中兴奋性谷氨酸能突触标志物暂时增加(参见 Brighi 等人论文的图 3 和图 4 以了解图像情况,以及方法部分“2D 培养物的免疫染色和图像采集和分析”以获取分析详细信息)。

对 FMRP-KO 2D 培养物的进一步分析突出显示神经元和胶质基因表达和增生的改变、网络活动的增加和明显的过度兴奋,从而表明了这些 2D 体外模型如何能有效重现 FXS 的一些特征。

此外,由于与传统的 2D 细胞培养物相比,3D 脑模型在细胞相互作用组织复杂性方面有着令人信服的优势,并且可以更精确地模拟人脑的适当 3D 组织,因此作者通过这项研究工作首次提出了基于 hiPSC 衍生大脑类器官的 FXS 3D 人类体外模型。为此,他们生成并表征了 3D 自组装脑类器官,观察脑室和脑室下区域的适当形成条件,并揭示类器官成熟过程中深层皮质神经元的存在。作者设置了 FMRP-WT 和 FMRP-KO 脑类器官,并发现 3D FXS 模型显示类器官大小显著增加,以及 2D 条件下不同时间点的星形胶质细胞反应性也增加。

之,作者证明了这些体外 3D 平台能够重现 FXS 皮质表型的发育,并将脑类器官作为一种新的有前途的工具来研究此病理学、提供采取其他方式难以获得的人体模型(参见 2021 年 Brighi 等人论文,了解详情)。

此处我们展示了使用 CrestOptics X-Light V3 转盘采集脑类器官图像的示例,这与 Brighi 等人论文中更广泛报道的情况类似。

通过免疫荧光检测进行脑类器官形态分析的一个大的困难是在直径可达几毫米的结构中存在固有的异源性细胞群。此外,全脑类器官可以在体外重现不同的大脑区域,包括前脑背侧、视网膜和海马体。因此,CrestOptics X-Light V3 是一个系统,可在短时间内获取显示整个组织总体概况的图像,它提供一种清晰的方法来识别哪些是要聚焦的兴趣区域,同时还可保持出色的分辨率。作为概念证明,图 A 显示了一个代表类器官切片的拼接图像,该切片显示脑室样结构中神经祖(SOX2+,绿色)细胞的清晰组织;利用类器官整体视图可将其他区域从形态分析中排除,并将注意力仅集中在神经上皮区域,标志物 SOX2(绿色)呈阳性。

图 A:大量采集的第 50 天人脑类器官情况,显示 SOX2+ 神经祖细胞(绿色)的清晰组织,形成类似于脑室和脑室下区的组织结构。核用 DAPI 染色(蓝色)。比例尺:500 um。此图像是使用 CrestOptics X-Light V3 转盘获取的。

图 B: 第 50 天人脑类器官的大图像,显示 CTIP2 阳性深层皮层神经元(白色)和泛神经元 MAP2 标志物信号(红色)。核用 DAPI 染色(蓝色)。比例尺:500 um。此图像是使用 CrestOptics X-Light V3 转盘获取的。

同样,如 B 所示,与 Brighi 等人论文中显示的相似,很容易发现皮质深层神经元的存在(CTIP2+ 白色,MAP2+ 红色),这些神经元向外围分化,形成典型的层状皮质结构。

一旦确定了感兴趣区域,就可更容易地以更高的放大倍数研究皮质区域的三维生物复杂性,从而加深对皮质层组织的了解(图 C)

图 C: CTIP2 阳性皮质神经元(白色)和泛神经元 MAP2 标志物(红色)的最大强度投影。比例尺:50 um。此图像是使用 CrestOptics X-Light V3 转盘获取的。

总而言之,使用 CrestOptics X-Light V3 转盘可以在几分钟内获得一个图像,该图像代表整体上与大脑类器官一样复杂的样本,且在其整个厚度的高速切片期间使用多个波长。同时,可以通过更高的放大倍数深入了解细胞仅在样本的某些部分呈现的三维结构,从而获得分辨率非常高的图像,同时可避免由于此转盘系统速度极快而导致的光漂白问题。

显微镜方法

有关 2D 图像采集和分析的详细信息,请参阅 Brighi 等人论文的方法部分“2D 培养物的免疫染色和图像采集和分析”。

此处显示的大脑类器官图像是通过尼康 Eclipse Ti2 显微镜采集的,其中显微镜配备 X-Light V3 转盘 (CrestOptics)、Celesta 激光源 (Lumencore) 和 Prime BSI 科学级 CMOS (sCMOS) 相机(6.5 um 像素大小,Photometrics)。图像是使用 5.30.02 版 NIS-Elements 显微镜成像软件(尼康)获取的。

图 A 显示第 50 天人脑类器官的最大强度投影 (MIP),这是以 0.9 µm 的 Z 步长和 23 µm 的 Z 范围在堆栈中利用 CFI Plan Apo Lambda 20 倍空气物镜(数值孔径 0.75,工作距离 1)采集到的。

图 B 显示第 50 天人脑类器官的 MIP,这是以 2 µm 的 Z 步长和 20 µm 的 Z 范围在堆栈中利用 CFI Plan Apo Lambda 20 倍空气物镜(数值孔径 0.75,工作距离 1)采集到的。

图 C 图像显示第 50 天人脑类器官的 MIP,这是以 0.3 µm 的 Z 步长和 21 µm 的 Z 范围在堆栈中利用 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜(数值孔径 1.4,工作距离 0.13)采集到的。这些图像通过 NIS-Elements 软件使用高级降噪 (AdDen)反卷积 (Dec) 算法进行处理

参考文献

Brighi C, Salaris F, Soloperto A, Cordella F, Ghirga S, de Turris V, Rosito M, Porceddu PF, D’Antoni C, Reggiani A, Rosa A, Di Angelantonio S. Novel fragile X syndrome 2D and 3D brain models based on human isogenic FMRP-KO iPSCs.

Cell Death & Disease, 12(5):498 (2021 May 15) doi: 10.1038/s41419-021-03776-8.

Re-use of images from this article is done under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license.

The application note has been prepared in collaboration with Dr. Carlo Brighi, Dr. Alessandro Soloperto, Dr. Federico Salaris, Prof. Alessandro Rosa and Prof. Silvia Di Angelantonio.

Center for Life Nano- & Neuro-Science,Sapienza University of Rome(CL2NS@Sapienza – Italian Institute of Technology).

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