具有低放大率物镜的结构照明显微术

在 CrestOptics,我们致力于让所有研究人员都能获得超分辨率 (SR),并将他们的科学潜力和突破提升到更高水平。

我们的最新产品 DeepSIM 基于多点结构照明系统,能够研究高达 ~100nm 的 XY 分辨率的细胞结构,而无需应用任何特定的样本制备方案。

结构照明显微术,作为所有的 SR 技术,通常与诸如 100 倍和 60 倍的高倍放大透镜的使用有关;然而,我们设计的 DeepSIM 也支持 40 倍和 20 倍。

 

在本应用说明中,我们证明了在 20 倍的低放大倍数物镜下也可以获得两倍的增强空间分辨率,这使得我们的 SR 模块成为一种可靠、易于使用且价格合理的解决方案,可用于研究亚细胞细节并扩大应用范围,包括复杂的三维 (3D) 模型,例如组织、球体和类器官。

低放大倍数下清除后样本的超分辨率成像

为了证明 DeepSIM 在低放大率物镜下的最佳性能,我们使用 CFI Plan Apo Lambda 20 倍空气物镜 (NA 0.75,WD 1) 比较了复杂和厚清除后生物样本中的宽视野 (WF)、共焦 (CF) 和 SR 图像。

1中,显示了清除后小鼠肠切片(0.55 mm 厚)的不同可视化,血管为绿色,细胞核为红色。特别是,由于三种显微术方法之间的快速切换,我们报告了 125 um 体积的 WF、CF 旋转盘和 SR 采集的全局比较(图 1A)和 DeepSIM SR 采集的 3D 电影,显示了小肠绒毛的精细细节(图 1B)。

A

Illumination microscopy
Illumination microscopy 2

B

图 1:清除后小鼠肠切片,显示血管(绿色)和细胞核(红色)。(A) WF、CF 转盘和 DeepSIM SR 3D 体积视图的比较。(B) DeepSIM SR 采集的 3D 影片,125 um 厚度。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 20 倍空气物镜获得。

图 2显示了具有表达 GFP 神经元的清除后小鼠脑切片(0.55 mm 厚)。值得注意的是,我们获得了一个 150 um Z 叠加的复杂神经元网络,显示为最大强度投影 (MIP)(图 2A)和 3D 体积视图(图 2B)。

从这些图像中可以看出,从 WF、CF 和 SR 模态切换可实现不断增加的分辨率增益,这增强了神经元网络的精细细节,即使在高厚度下也是如此。

此外,我们决定将 20 倍 SR 采集与 60 倍 CF 采集进行比较,如图 2C 和 2D 所示,与 20 倍 CF 采集相比,DeepSIM 采集不仅分辨率明显提高,而且图像质量可与配备了 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜 (NA 1.4,WD 0.13) 的 CF 旋转盘相比。相对于 20 倍 CF(图 2D)而言,除了神经元细节质量的显著增强之外,使用配备了 20 倍物镜的 DeepSIM 可以比普通 60 倍油物镜 (130 um) 的最大工作距离更深入样本(图 2C)。

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图 2:带有 GFP 表达神经元的清除后小鼠脑切片。(A) 比较使用 20 倍空气物镜进行的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 采集,显示为来自 Z 叠加的最大强度投影;(B) 使用 20 倍空气物镜获得的 3D 体积视图,150 um 厚。(C) 使用配备了 20 倍空气物镜的 DeepSIM SR 模块(左)和配备了 60 倍油物镜的 CF 旋转盘(右)获得的 3D 体积视图之间的比较。(D) 侧重于神经元细节和三种不同采集模态之间的比较:配有 20 倍空气物镜的 CF 旋转盘(左)、配有 60 倍油物镜的 CF 旋转盘(中)和配有 20 倍空气物镜的 DeepSIM SR 模块(右)。

低放大率下常规制备样本的超分辨率成像

透明试剂可以使生物组织透明,减少光散射,并提高非常厚的标本的可视化深度。然而,DeepSIM 还可以在常规制备的样本中提供 SR,在常规制备的样本中,主要生物成分的不同折射率会导致光在穿过组织时发生更大的散射。

因此,我们测试了一些常规制备的样本,例如类脑器官和小鼠脑切片,进行通常用共聚焦显微镜进行的采集。

人类全脑类器官能够在体外重现最早的神经发育事件,在细胞相互作用和组织结构方面,模仿发育中人脑的真实 3D 组织。

3 中,显示了 CTIP2 阳性深层皮质神经元(绿色)和泛神经元 MAP2 标记(红色)的人脑器官样切片(50 um 厚)。特别是,我们将重点放在皮质板上,对 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像进行比较,这些图像使用 20 倍空气物镜采集,并显示为来自 Z 叠加 (15 um) 的 MIP。同样,在三种采集模态之间切换,使用 DeepSIM 时,我们显著提高了分辨率和图像质量,增强了皮质深层神经元的精细细胞结构,这些神经元向外周分化,形成了典型的层状皮质结构。

图 3:显示 CTIP2 阳性深层皮质神经元(绿色)和泛神经元 MAP2 标记(红色)的人脑类器官。比较使用 20 倍空气物镜采集的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像,显示为来自 Z 叠加的最大强度投影

4 中,我们报告了另一个常规制备样本的图像:来自 Thy1-GFP 小鼠大脑的海马冠状切片(50um 厚),并分析了使用 20 倍空气物镜进行的采集(图 4A),使用 DeepSIM 获得的分辨率增益非常明显,在这个非常分散的样本中也是如此。此外,侧重于海马神经元网络复杂组织内部的神经元细节,我们将 20 倍 SR 采集与 60 倍 CF 图像进行了比较。如图 4B 所示,配备 20 倍空气镜头的 Deep SIM 可以达到与配备 60 倍油物镜的 CF 转盘相当的图像质量。

A

Illumination microscopy 3

B

图 4:Thy1-GFP 小鼠大脑海马冠状切片。(A) 比较使用 20 倍空气物镜采集的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像,显示为来自 Z 叠加的最大强度投影(B) 侧重于神经元细节和三种不同采集模态之间的比较:配有 20 倍空气物镜的 CF 旋转盘(左)、配有 60 倍油物镜的 CF 旋转盘(中)和配有 20 倍空气物镜的 DeepSIM SR 模块(右)。

总之,所有这些数据共同证明了 DeepSIM 使用常规制备方案在超大物体中显示精细细节的能力。价格合理、易于使用的低放大率干物镜也可用于采集常规和非常规样本,使物镜性能加倍,并获得与浸没透镜非常相似的图像质量。

将 DeepSIM 与低放大率物镜配合使用,可以在不影响图像质量的情况下,受益于空气镜头的所有优势,例如没有浸没介质或工作距离更大。这种类型的配置极大地增加了系统的可塑性,并为我们的客户提供了更大的应用灵活性,将 DeepSIM 作为 SR 成像的强大平台,为在高含量筛选中使用 SR 奠定了基础。

显微成像方法

本应用说明的所有采集均通过配备 CrestOptics X-Light-V3 旋转盘系统的 Nikon Eclipse Ti2 显微镜进行,该显微镜还配备 DeepSIM 超分辨率附件、LDI 激光照明器 (89 North) 和 6.5 um 像素(光学性质)的 Prime BSI Scientific CMOS (sCMOS) 摄像机。我们使用了 CFI Plan Apo Lambda 20 倍空气物镜 (NA 0.75,WD 1) 和 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜 (NA 1.4,WD 0.13)。

图 3 所示的人类大脑类器官和图 4 所示的小鼠大脑切片由生命纳米和神经科学中心 (CLN2S@Sapienza Università di RomaIstituto Italiano di Tecnologia) 的 Silvia Di Angelantonio 教授Maria Rosito 博士Federica Cordella 博士 Caterina Sanchini 博士提供。

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