依赖SAG的小脑神经球 (S-cNS) 作为颗粒细胞前体 (GCP) 培养的验证

根据最近意大利罗马一大 (La Sapienza) 分子医学系的朱塞佩·强尼尼(Giuseppe Giannini)博士实验室进行的一项研究,用于培养出生后小脑颗粒细胞前体(GCPs)如长期神经球的一种创新方法已经获得验证。在保持SHh通路活性的状态下,被 Smo激动剂(SAG)诱导的GCPs可以高度自我更新或者在适当条件下可以分化为颗粒细胞(GCs)。

迄今为止,用于体外研究GCPs的是不良且效率低下的细胞模型。 出生后5至7天(P5-7)小鼠的小脑外植体通常用于建立SHh通路刺激下的短期GCP培养物或在含有EGF(表皮细胞生长因子)/ bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)(GF)混合物的“干细胞培养基”中生长的长期神经球。 不过,bFGF会抑制SHh通路活性,这表明该条件不适用于繁殖具活性SHh信号的细胞。

在这项研究中,作者具体描述了依赖SAG激动剂的小脑神经球(S-cNS)对比依赖GF的小脑神经球(GF-cNS)的特征。他们发现与短期GCP培养相似,S-cNS而非GF-cNS表现出SHh通路的持续功能活性。此外S-cNS中的细胞能够将EdU整合到SAG处理中。

此外,作者观察到整体表达谱中两条线之间存在有意思的差异,这表明小脑神经球的两个群体的身份差异大。特别是S-cNS以更高水平的GCP标记表达,如ATOH1,PAX6和双皮质素(DCX)蛋白(图A)。后者在包含神经球的大多数细胞中广泛表达,而GF-cNS则显示出神经丝干细胞的特征性标志物中间丝巢蛋白(Nestin)(图B)的表达明显更高(更多信息请参见Petroni等其他人论文,2019)。

图A. DCX蛋白的免疫荧光分析

S-cNS和GF-cNS神经球的DCX(绿色)和DNA(蓝色)染色。 与GF-cNS不同,S-cNS神经球在大多数细胞中均表现出分散的DCX定位。比例尺10毫米。

图B. 巢蛋白的免疫荧光分析

S-cNS和GF-cNS神经球的巢蛋白(红色)和DNA(蓝色)染色。与S-cNS不同,GF-cNS神经球显示出巢蛋白的高表达。比例尺10毫米。

为了进一步检查S-cNS是否代表GCP,这些和GF-cNS都被诱导分化。 源自S-cNS的细胞表现出典型的神经元样形态,以跨越不同长度的神经突的梭形细胞体为特征。 此外其中绝大多数表达神经元标记物b3微管蛋白、GABRA6蛋白和VGLUT1蛋白(图C),这表明它们已分化为GCs。

相反地,绝大多数GF-cNS衍生细胞具有星形神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的阳性表型,仅偶尔显示出b3微管蛋白阳性神经元样外观(图C和图D),表明测定胶质细胞。 此外GF-cNS细胞群对GABRA6蛋白和VGLUT1蛋白完全阴性(图C)。

图C. B3微管蛋白、GABRA6蛋白和VGLUT1蛋白的免疫荧光分析

S-cNS和GF-cNS神经球的B3微管蛋白(绿色),GABRA6蛋白(红色),VGLUT1蛋白(红色)和DNA(蓝色)染色。 与GF-cNS不同,S-cNS神经球显示神经元标记物的高度表达。 比例尺10毫米。

图D GFAP蛋白的免疫荧光分析

S-cNS和GF-cNS神经球的GFAP(绿色)和DNA(蓝色)染色。与S-cNS不同,GF-cNS神经球表现出高水平的GFAP神经胶质标记物。比例尺10毫米。

这些数据表明, S-cNS代表并未在体外转化的一种新的长期且近乎同质的GCPs增殖种群通过激活SHh通路(在SAG作用下)在培养物中得以维持。

SHh信号使Atoh-1阳性GCPs扩增以协调适当的小脑组织发生。有关该通路的复杂调节已部分说明。在缺乏SHh的情况下,12次跨膜受体Patched 1(Ptch1)组成性抑制7次跨膜G蛋白偶联受体Smoothened(SMO),使该通路不起作用。但SHh与Ptch1结合后,在SMO上的抑制作用得以缓解,该通路被激活。敲除PTCH1基因和某些SMO突变(例如SMO-M2)都能够诱导小鼠中的SHH髓母细胞瘤。

利用S-cNS模型,作者发现敲除PTCH1而非SMO-M2突变体足以维持组成型活性SHh信号通路并在自主细胞环境中支持GCP存活/增殖。该论文表明,在SMO-M2突变体下,PTCH1至少可以对SMO受体产生部分抑制作用,但是该抑制作用可以通过SAG释放。 因此作者证明了S-cNS可用于解决与SHh信号传导有关的问题,原则上可解决与GCP / GC有关的任何涉及自然和自主细胞环境的其他生物和生化问题。

方法

用浓度4%的福尔马林加入0.1 M磷酸盐缓冲液,pH值 7.2,将S-cNS和GF-cNS细胞以4 °C温度固定24小时。在磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗后,将神经球在室温下以1200 rpm的速度离心3分钟,然后在最佳切割温度下的化合物中冷冻。如图中所示,通过免疫荧光分析法对冷冻切片的巢蛋白和双皮质素(DCX)进行了分析 。 或者将两种培养物接种在聚赖氨酸板上并在合适的条件下诱导分化。贴壁细胞在室温下在3.7%甲醛/磷酸盐缓冲液中固定15分钟并通过免疫荧光法分析b3微管蛋白、GABRA6、VGLUT1和GFAP,如图所示。荧光染料HOECHST用于染色细胞核(显示为蓝色)。使用了ProLong Glass Antifade Mounting 封片剂(Invitrogen品牌)。

该图像通过尼康Eclipse Ti倒置显微镜采集完成,配备X-Light V2(CrestOptics)转盘,LDI激光源(89 North),6.5 μm像素(Photometrics)的Prime BSI 科学级高性能 CMOS(sCMOS)相机 。 使用了7.10.2版的Metamorph软件 (Molecular Devices品牌)获取图像。100倍物镜PlanApo Lambda系列(数值孔径1.45),在Z中切片,步距为0.1 µm。 使用ImageJ和NIS-Elements AR 5.20尼康软件处理图像。

Reference

SMO-M2突变不支持小脑颗粒细胞前体中的细胞自主性刺猬信号(SMO-M2 mutation does not support cell-autonomous Hedgehog activity in cerebellar granule cell precursors)

作者: Petroni M, Sahùn Roncero M, Ramponi V, Fabretti F, Nicolis Di Robilant V, Moretti M, Alfano V, Corsi A, De Panfilis S, Giubettini M, Di Giulio S, Capalbo C, Belardinilli F, Coppa A,Sardina F, Colicchia V, Pedretti F, Infante P, Cardinali B, Tessitore A, Canettieri G, De Smaele E, Giannini G.

2019年12月23日《科学报告》(Sci Rep);9(1):19623. doi: 10.1038/s41598-019-56057-y

按照知识共享署名(CC BY)的条款和条件来重复使用本文中的图像。

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