使用结构照明显微术观察活细胞的细节和动态

超分辨率 (SR) 技术面临的最大挑战之一是,在跟踪生物事件动态的同时增强活细胞的亚细胞细节。由于采集速度慢、穿透深度不足以及需要特殊探针,目前 SR 商业解决方案的适用性仅限于整个活细胞成像需求的一小部分。

借助 DeepSIM,我们成功完成了一项重要任务,即提供一种可靠、易用且价格合理的解决方案,以扩展当前 X-light V3 旋转盘成像能力,从活体异质标本中获取 SR 数据。

在本应用说明中,我们证明了凭借 > 10 fps 的时间分辨率,Deep SIM 可以在细胞和亚细胞水平上跟踪活细胞动态。特别是,我们监测了快速生物事件,重点是溶酶体小泡的运动,以及较慢和持久的现象,例如细胞有丝分裂。

溶酶体囊泡的实时超分辨率示踪

为了证明 DeepSIM 在以下快速生物事件中的最佳性能,我们对永久表达 GFP-α 微管蛋白的 HeLa 细胞进行了实时成像,并使用 Spirochrome SiR 溶酶体探针对溶酶体进行了染色。

1 中,我们比较了宽视野 (WF)、共焦 (CF) 和 SR 图像,证明其分辨率比传统显微术有显著提高。

图 1:比较表达 GFP-α 微管蛋白(绿色)和溶酶体染色(红色)的 HeLa 细胞的 WF、CF 旋转盘和 DeepSIM SR 图像。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。

此外,在 2 中,在去卷积的旋转盘和 SR 数据之间进行平行比较,可以评价溶酶体囊泡的一些细节,相对于去卷积的 CF 图像,如何在 SR 图像中检测,更鲜明并且肯定更清楚。

图 2:显示溶酶体囊泡细节的去卷积 CF 和 SR 数据之间的平行比较;CF 图像的去卷积由 NIS Elements 软件提供的 3D Richardson-Lucy 算法进行。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。

由于可以将 CrestOptics X-Light V3 旋转盘DeepSIM SR 模块一起使用,因此可以在大视野 (FOV) 上进行快速实时成像(图 3A),从大量细胞中获得重要数据,然后聚焦于单个细胞,在亚细胞水平上跟踪溶酶体动态(图 3B)。

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图 3:HeLa 细胞溶酶体染色的快速实时成像。(A) 大视野中的 CF 采集;(B 顶部)CF 采集和单细胞聚焦;(B 底部)SR 采集和单细胞聚焦。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。

DeepSIM 高速采集模态允许以高分辨率捕捉相关数据,从而最大限度地减少光暴露和由此产生的光毒性风险。正如 4 中报告的那样,这种功能可随着时间的推移探索精致标本的动态和追踪溶酶体囊泡。特别是,进行了连续 30 秒的 DeepSIM SR 延时(图 4A),监测快速事件而不用担心褪色。随着时间的推移,图像质量和溶酶体的运动性得以保持,这使得从溶酶体的跟踪中提取重要数据成为可能,例如囊泡移动的距离 (um) 和速度 (um/s)(图 4B)。

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图 4:SR 实时溶酶体跟踪。(A) 连续 30 秒 DeepSIM SR 延时;(B) 溶酶体囊泡移动的距离 (um) 及其速度 (um/s)。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。

这些数据共同表明,DeepSIM 结合了高速成像与光效率和灵敏度。快速生物事件可以在亚细胞水平上随时间推移进行监测,而不会出现褪色问题,从而有机会在活体标本上以高分辨率获取相关数据。

细胞分裂的长期实时超分辨率成像

为了证明 DeepSIM 在长期生物事件中的最佳性能,我们对 HeLa 细胞进行了实时成像,这些细胞分别用 Spirochrome SPY 505-DNA 和 SPY 555 微管蛋白探针进行了 DNA 和微管蛋白染色。

利用 CrestOptics X-Light V3 旋转盘DeepSIM SR 模块,我们有机会进行 CF 采集,以便对样本有一个总体了解(图 5A)。确定了感兴趣的区域后,由于不同成像模态之间的快速、简单切换,我们可以通过 SR 成像发现正在分裂的细胞并跟踪其整个有丝分裂过程。事实上,在 5B 中报告了 33 分钟的实时 SR 延时,显示了不同的有丝分裂期,具有非常清晰的细节。

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图 5:在使用 Spirochrome SPY 505-DNA(绿色)和 SPY 555 微管蛋白(红色)探针染色的 HeLa 细胞上实时成像。(A) 大视野中的 CF 采集;(B) 单细胞聚焦,显示 33 分钟的实时 SR 延时。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。

传统结构照明显微术 (SIM) 的主要缺点之一是光子剂量及其与精细生物事件的兼容性;持续暴露在光线下会损害正在进行的生物现象,这可能是一个问题,尤其是当我们考虑 SIM 图像重建需要多个图像时。

在这方面,为了证明 DeepSIM 不牺牲样本活力和生理机能的能力,我们对细胞进行了超过 12 小时的监测,如 6 所示,细胞的健康状况丝毫没有受到损害,细胞分裂和无细胞死亡就是证明。值得注意的是,随着时间的推移,图像质量依然得以保持,可进行更长时间的延时实验,而没有光毒性和光漂白问题。

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图 6:细胞分裂的长期 SR 成像。(A) 12 小时延时 SR 实验;(B) SR 中显示的有丝分裂期。这些图像使用 CrestOptics X-Light-V3 CF 旋转盘系统结合 DeepSIM SR 附件并配置 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜获得。

总之,这些数据共同表明,DeepSIM SR 模块的时间分辨率超过 10fps,光子负载低,能够轻松研究活细胞动态,并使用常规样本制备方案提供结构化定位成像。长期和快速生物事件都可以随着时间的推移进行监测,而不必担心褪色,从而有机会在亚细胞水平上跟踪生物动态,并利用 SIM 在活体样本上捕获有意义的数据。 

显微成像方法

本应用说明的所有采集均通过 Nikon Eclipse Ti2 显微镜进行,该显微镜配有 CrestOptics X-Light-V3 旋转盘系统,还配备了 DeepSIM 超分辨率附件、LDI 激光照明 (89 North)、具有 6.5 um 像素的 Kinetix sCMOS 摄像机(光学性质)和 CFI Plan Apo Lambda 60 倍油物镜 (NA 1.4,WD 0.13)。

使用 Spirochrome 荧光探针进行细胞染色,用于活体生物成像 (Spirochrome)。特别是,我们使用 SPY 505-DNA、SPY 555 微管蛋白和 SiR 溶酶体探针标记细胞。

用于追踪溶酶体的电影记录了 30 秒,没有延迟;用于细胞分裂成像的电影记录了 33 分钟(3 分钟延迟)(图 5B)和 12 小时 15 分钟(15 分钟延迟)(图 6A)。

本应用说明中显示的 HeLa 细胞由 Consiglio Nazionale delle Ricerche c/o Sapienza Università di Roma 分子生物学和病理学研究所的 Lia Asteriti 博士和 Giulia Guarguaglini 博士提供。

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