从眼睛到大脑:人类干细胞衍生的视网膜神经节细胞的网状结构

罗马生命纳米科学中心(CLNS @ Sapienza –意大利技术研究所)的Silvia Di Angelantonio博士和其合作者Alessandro Soloperto博士致力于制定出有效的关于视网膜神经元体外发育的分化协议方案,研究TAU蛋白折叠的变化如何与视网膜生理和病理学联系起来。

特别是通过多步分化法产生诱导多能干细胞iPSC)自体来源的视网膜神经节细胞(RGSs)。该方法依赖于可以使干细胞进入正确分化路径的小分子。其流程持续约30天至35天,形成具有功能性、一致性且分布良好的二维视网膜神经元。然后将细胞固定并用DAPI进行DNA染色(以白色显示),还有三个分化标志物,用以确认视网膜神经元特定亚型的产生:视网膜神经节细胞。以下是使用的标志物列表:

MAP2(黄色)存在于神经元树突细胞骨架中的微管相关蛋白。

Tuj1(品红色)可染色神经元特异性III类β-微管蛋白,是轴突细胞骨架的主要成分,被广泛用于区分神经元与其他细胞类型的标志物。

Brn3a(青色)此转录因子在中枢神经系统的多个位点(包括视网膜)表达。这里Brn3a识别视网膜神经节细胞的特定亚型,并调节涉及轴突寻路、树突分层和靶标选择的下游基因表达。

我们利用尼康Ti2倒置显微镜进行了采集,配有CrestOptics共聚焦旋转盘X-Light V3,Photometrics 95B显微镜相机(11 um像素大小)和Celesta激光源(Lumencor)。此40倍图像(尼康 40倍水物镜,NA 1.25),透过拼接工具(图A)和观察区域的三维图(图B)所获得。

研究人员利用采集系进行大视野观察来评估整个细胞培养中的分化程度。 在A中,Tuj1染色(品红色)表现出突分枝模式,并与Brn3a染色(青色)结合,再综合网膜神经节细识别,显示Brn3a阳性核。 由此可针对特定区域获得三维 Z堆栈,再进行定量分析。

图B所示为观察区域里三维 Z堆栈的最大强度投影和体积图。 此外,我们对图B中的特定区域进行了测量,如图C所示范例。例如:通过设置DAPI(白色)和Brn3a(青色)阳性细胞的阈值并结合获得的两个阈值,就可以计算出两个对象均为阳性的对象数(例如:将10个对象测量为“合并阈值”- 以橙色显示 – 在使用DAPI识别的21个核总数中;使用NIS元素“常规分析”工具获得测量值)。用这些数据可以计算细胞培养中分化方案的效率(即为47%)。

值得注意的是,源自人类干细胞的视网膜神经节细胞不仅可以代表一种新型的体外模型,可加深在老年性疾病(如阿尔兹海默症和帕金森病)期间大脑和视网膜中所发生的神经退行性过程,而且还可以作为测试治疗方法的模型。

图A:

大视野(拼图)

图B:

最大强度投影

体积图

图C:

Brn3A阳性核计数

合并

DAPI 阈值

Brn3A阈值

合并阈值

该应用说明是由Alessandro Soloperto和Silvia Di Angelantonio共同编写的。

罗马生命纳米科学中心(CLNS @ Sapienza –意大利技术研究所)

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